高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷的含量_刘少文
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采 用 Techpshere ODS C18(250×4.6 mm，5 μm)，流 动 相 ： 甲醇∶水＝25∶75，流速：1.0 ml/min，检测波长：270 nm，室温，进 样量为 5.0 μl。 采用上述色谱条件的分离度均大于 1.5，理论 塔板数以龙胆苦苷计算≥8 000。 2.4 空白对照实验
精密吸取色谱甲醇，用色谱甲醇定容至 5 ml 容量瓶中作 为空白样品，吸取 5.0 μl 注入 高效 液 相 色 谱 仪 器 中 ，结 果 在 与对照品龙胆苦苷相同的保留时间位置，并没有出现其他的 干扰峰，表明溶解龙胆苦苷的甲醇对龙胆苦苷的峰无干扰。 2.5 线性关系的考察
精密吸取 对 照 品 溶 液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分 别 用 甲 醇定容至 10 ml 容量瓶中，分别吸取 5.0 μl 注入高效液相色 谱仪，每个浓度重复进样 3 次，以龙胆苦苷浓度为横坐标，峰 面积 A 为纵坐标， 绘制标准曲线， 从而得到回归方程为 Y＝ 304.95X－17.886（r＝0.999 7）；龙 胆 苦 苷 在 0.2 ～1.0 mg/ml 之 间
2
0.664 1 1.236 5 1.1246 2.312 4 99.15 99.28 1.01
4
0.658 2 1.210 9 1.1246 2.281 0 99.09
5
0.661 0 1.230 1 1.1246 2.301 2 99.07
2.9 稳定性考察 取相同的供试品溶液 5.0 μl，，分别在 0、4、8、12、24、36、
[2] 郜尽,孙文基,冯英菊,等.反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中龙胆苦 苷 的 含 量 [J]. 陕 西 中 医 学 院 学 报 ,2002,25(3):58-59.
[3] 聂中越,程淑娟.HPLC 法测定龙胆复方制剂中龙胆苦苷的实验研究[J]. 深 圳 中 西 医 结 合 杂 志 ,2002,12(3):174-175.
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10
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48 h 后注入高效液相色谱仪中，测得其龙胆苦苷的峰面积的 RSD=0.96%，结果表明，48 h 内龙胆苦苷样品的稳定性良好。 2.10 样品含量的测定
分别取 10 批龙胆苦苷药材粉末各 0.5 g， 精密称定后， 按照上述样品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照选取的 色谱条件测定 10 批龙胆药材中龙胆苦苷的含量， 测定结果 见表 2。 3 结论
[J]. 中 国 药 事 ,2007,21(9):731. [7] 李 虹.高 效 液 相 色 谱 法 测 定 苦 胆 草 胶 囊 中 龙 胆 苦 苷 的 含 量[J].时 珍 国
2011 年 1 月第 18 卷第 3 期
论著
高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷的含量
刘少文 （广东省佛山市中医院，广东佛山 528000）
[摘要] 目的：建立龙胆中龙胆苦苷的高效液相色谱测定方法 。 方法：采用 HPLC 法，其 中色 谱 柱 为 Techpshere ODS
C18（250×4.6 mm，5 μm）,（流动相：甲醇:水＝25:75），流速：1.0 ml/L；检测波长：270 nm；进样量为 5.0 μl，柱温为室温。
结果：龙胆苦苷在 0.2～1.0 mg/ml 之间线性关系良好，线性回归方程为 Y＝304.95X－17.886，r＝0.999 7；测 得 的龙 胆 中
龙胆苦苷的回收率为 99.28%，RSD 为 1.01%。 结论：该方法操作简单，且分离效果好，检测的灵敏度高，重现性好，可
以作为测定龙胆中龙胆苦苷含量的检测方法。
实验过程中对文献报道的流动相的比例选择作了反复 的 试 验[2]，当 采 用 甲 醇∶水=25∶75 时 ，龙 胆 苦 苷 与 其 干 扰 峰 可
样品编号 1
表 2 10 批龙胆药材中龙胆苦苷的含量测定结果
取样量
峰面积
龙胆苦苷含量 龙胆苦苷含量
（g）
（mAU/s）
（mg）
Байду номын сангаас
（%）
0.5
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13.3
CHINA MODERN MEDICINE 中国当代医药 11
论著
2011 年 1 月第 18 卷第 3 期
线性关系良好。 结果见图 1。
图 1 样品中龙胆苦苷色谱图（2 号为龙胆苦苷）
2.6 精密度考察 精 密 吸 取 对 照 品 溶 液 5.0 μl，重 复 进 样 6 次 ，从 而 测 定
龙胆苦干的平均峰面积为 2 356.589 7，RSD=0.96%， 显示进 样的精密度良好。 2.7 重现性考察
2 色谱条件与结果 2.1 对照品溶液的制备
精密称取龙胆苦苷标准品 10.0 mg，加甲醇定容至 25 ml 容量瓶中，作为对照品溶液，储存备用。 2.2 供试品溶液的制备
精密称取粉碎后过筛的 10 批龙胆苦苷药材粉末各 2.5 g， 分别加入甲醇 25 ml，置超声过滤器中 ，超 声 30 min，冷 却 后 过滤，移液管各移取续滤液 1 ml 置 5 ml 容量瓶中，分别用甲 醇定容至刻度，作为供试品备用。 2.3 色谱条件的选择
表 1 样品回收率测定结果
取样量 样品中龙胆苦 对照片加 测定量 回收 平均回收 RSD 样品编号
（g） 苷含量（mg） 入量（mg） （mg） 率（%） 率（%） （%）
1
0.654 8 1.203 5 1.1246 2.251 4 99.04
2
0.657 9 1.212 0 1.1246 2.245 6 99.10
龙胆为龙胆科植物以及中药材龙胆的统称。 植物龙胆 在中国大陆、俄罗斯、日本、朝鲜等均有分布，生长于海拔 400～1 700 米的地区。 中国有龙胆属 240 多 种 ，多 产 于 西 南 高山地区，北京周边只有少数的几种，龙胆更是重要的药用 植物，其根和根茎入药具有清热、泻肝、定惊等功效。 《中华 人 民 共 和 国 药 典 》2005 版 记 录 ，龙 胆 的 干 燥 根 及 根 茎 ，具 有 清热燥湿、泻肝胆火之功效，龙胆的药用历史悠久，历代本 草 均 有 记 载 ，是 常 用 的 苦 寒 健 胃 保 肝药 物[1]。 研 究 表 明 龙 胆 苦苷为其主要的活性成分，具有保肝、利胆、健胃、抗炎以及 抗菌等功效，因此，为了更好的控制药品的质量，笔者采用 高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷的含量， 以期为该药 材有效成分的含量测定提供更好的鉴定方法， 现将结果报 道如下： 1 仪器与试剂 1.1 仪器
Agrilent 1100 高效液相色谱仪，紫外光谱检测器，Agilent 1100 色谱工作站，C18 色谱柱（Techpshere ODS C18，250×4.6 mm， 5 μm），Agrilent 进样瓶，分析天平（美国梅 特 勒 有 限 公 司 ，精 密度 0.001）。 1.2 试剂
甲醇（北京北化精细化学有限责任公司，批号20081116，分 析纯），甲醇（北京北化精细化学有限责任公司，批号20081201， 色 谱 纯 ），水 （娃 哈 哈 纯 净 水 ），龙 胆 苦 苷 对 照 片 （中 国 药 品 生 物制品检定所，批号 20071203），10 批龙胆药材（分别各粉碎 后过 5 号筛，后置 50℃的干燥烘箱中干燥至恒重）。
24.6
4.92
以完全分开。 本实验还对超声时间作了对比 ，分别采用 20、 30、40 min 对龙胆苦苷的提取率进行比较，结果，采用超声时 间为 30 min 时的提取率与 40 min 的提取率相同， 因此实验 确定了超声提取时间为 30 min[3]。
在选择检查波长时， 笔者取样品在 200～375 nm 的波长 范围内进行扫描， 结果在 270 nm 波长处龙胆苦苷有最大吸 收，因此实验过程中选择 270 nm 作为本次监测实验的波长。 龙胆苦苷的含量测定方法相关的文献已经有报道[4-6]。 本文建 立的高效液相色谱方法用于对中药龙胆中龙胆苦苷进行含 量测定，经对对照品和供试品的制备方法的考察、测定条件 的选择、线性关系的考察、精密度测定、重现性考察、回收率 的测定、稳定性试验等方法学的考察，确定了正确的含量测 定 方 法 [7-8]。
该方法的重现性、精密度以及分离度均符合规定，并且 测定方法稳定，经过对样品检测数据的反复考察结果，确定 了高效液相色谱法用于中药龙胆中有效成分龙胆苦苷含量 测 定 的 可 行 性 ，具 有 可 应 用 性 [9]。
[参考文献]
[1] 李馨,王金宏,金迪,等.HPLC 法测定龙胆中龙胆苦苷的含量[J].黑龙江 医 药 ,2010,23(3):319-321.
[关键词] 高效液相色谱法；龙胆；龙胆苦苷；含量测定
[中图分类号] R927.2
[文献标识码] A
[文章编号] 1674-4721（2011）01（c）-011－02
Determination of Gentiopicrin in Gentian by HPLC
LIU Shaowen （Traditional Chinese Medicine Hospital of Foshan City, Guangdong Province, Foshan 528000, China ） [Abstract] Objective: To establish a HPLC method for the Gentiopicroside gentian chromatographic. Methods: Used HPLC method, in which column was Techpshere ODS C18(250×4.6 mm, 5 μm), (mobile phase:methanol:water＝25:75), flow rate: 1.0 ml/L; detection wavelength:270 nm; injection volume: 5.0 μl, Nm. Results: Gentiopicrin 0.2～1.0 mg/ml good linear relationship between the linear regression equation was Y＝304.95X-17.886,r＝0.9997; measured gentian recovery Gentiopicroside was 99.12%, RSD was 1.01%. Conclusion: The method is simple, and good separation, detection sensitivity, reproducibility, and can be used to determine the content of gentian gentiopicroside detection method. [Key words] HPLC; Gentian; Gentiopicrin;Content determination
[4] 国家药典委员会.中国药典[M].部.北京:化学工业出版社,2005:64. [5] 王臣,邢秀芳,马力祥,等.栽培条叶龙胆各形态类型龙胆苦苷含量的测
定[J]. 中 国 中 药 杂 志,2004,29(9):841. [6] 黄 铭 涛,许 波,田 颂 九.HPLC 法 测 定 肝 胃 气 痛 胶 囊 中 龙 胆 苦 苷 的 含 量
取 1 号龙胆样品，按照供试品溶液的制备方法平行制备 6 份 供 试 品 溶 液 ，各 取 5.0 μl 注入 高 效 液 相 色 谱 仪 ，测 得 龙 胆苦苷的 RSD=1.29%。 2.8 加样回收实验
取相同的龙胆药材粗粉 5 份，分别加入等量的龙胆苦苷 对 照 品 ，按 照 对 照 品 溶液 的 制 备 方 法 制 备 溶 液 ，各 取 5.0 μl 进 样 。 测 得 龙 胆 苦 苷 的 平 均 加 样 回 收 率 为 99.28% ，RSD= 1.01%。 结果见表 1。
精密吸取色谱甲醇，用色谱甲醇定容至 5 ml 容量瓶中作 为空白样品，吸取 5.0 μl 注入 高效 液 相 色 谱 仪 器 中 ，结 果 在 与对照品龙胆苦苷相同的保留时间位置，并没有出现其他的 干扰峰，表明溶解龙胆苦苷的甲醇对龙胆苦苷的峰无干扰。 2.5 线性关系的考察
精密吸取 对 照 品 溶 液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分 别 用 甲 醇定容至 10 ml 容量瓶中，分别吸取 5.0 μl 注入高效液相色 谱仪，每个浓度重复进样 3 次，以龙胆苦苷浓度为横坐标，峰 面积 A 为纵坐标， 绘制标准曲线， 从而得到回归方程为 Y＝ 304.95X－17.886（r＝0.999 7）；龙 胆 苦 苷 在 0.2 ～1.0 mg/ml 之 间
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0.664 1 1.236 5 1.1246 2.312 4 99.15 99.28 1.01
4
0.658 2 1.210 9 1.1246 2.281 0 99.09
5
0.661 0 1.230 1 1.1246 2.301 2 99.07
2.9 稳定性考察 取相同的供试品溶液 5.0 μl，，分别在 0、4、8、12、24、36、
[2] 郜尽,孙文基,冯英菊,等.反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中龙胆苦 苷 的 含 量 [J]. 陕 西 中 医 学 院 学 报 ,2002,25(3):58-59.
[3] 聂中越,程淑娟.HPLC 法测定龙胆复方制剂中龙胆苦苷的实验研究[J]. 深 圳 中 西 医 结 合 杂 志 ,2002,12(3):174-175.
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4.46
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12.5
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48 h 后注入高效液相色谱仪中，测得其龙胆苦苷的峰面积的 RSD=0.96%，结果表明，48 h 内龙胆苦苷样品的稳定性良好。 2.10 样品含量的测定
分别取 10 批龙胆苦苷药材粉末各 0.5 g， 精密称定后， 按照上述样品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照选取的 色谱条件测定 10 批龙胆药材中龙胆苦苷的含量， 测定结果 见表 2。 3 结论
[J]. 中 国 药 事 ,2007,21(9):731. [7] 李 虹.高 效 液 相 色 谱 法 测 定 苦 胆 草 胶 囊 中 龙 胆 苦 苷 的 含 量[J].时 珍 国
2011 年 1 月第 18 卷第 3 期
论著
高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷的含量
刘少文 （广东省佛山市中医院，广东佛山 528000）
[摘要] 目的：建立龙胆中龙胆苦苷的高效液相色谱测定方法 。 方法：采用 HPLC 法，其 中色 谱 柱 为 Techpshere ODS
C18（250×4.6 mm，5 μm）,（流动相：甲醇:水＝25:75），流速：1.0 ml/L；检测波长：270 nm；进样量为 5.0 μl，柱温为室温。
结果：龙胆苦苷在 0.2～1.0 mg/ml 之间线性关系良好，线性回归方程为 Y＝304.95X－17.886，r＝0.999 7；测 得 的龙 胆 中
龙胆苦苷的回收率为 99.28%，RSD 为 1.01%。 结论：该方法操作简单，且分离效果好，检测的灵敏度高，重现性好，可
以作为测定龙胆中龙胆苦苷含量的检测方法。
实验过程中对文献报道的流动相的比例选择作了反复 的 试 验[2]，当 采 用 甲 醇∶水=25∶75 时 ，龙 胆 苦 苷 与 其 干 扰 峰 可
样品编号 1
表 2 10 批龙胆药材中龙胆苦苷的含量测定结果
取样量
峰面积
龙胆苦苷含量 龙胆苦苷含量
（g）
（mAU/s）
（mg）
Байду номын сангаас
（%）
0.5
178 9
13.3
CHINA MODERN MEDICINE 中国当代医药 11
论著
2011 年 1 月第 18 卷第 3 期
线性关系良好。 结果见图 1。
图 1 样品中龙胆苦苷色谱图（2 号为龙胆苦苷）
2.6 精密度考察 精 密 吸 取 对 照 品 溶 液 5.0 μl，重 复 进 样 6 次 ，从 而 测 定
龙胆苦干的平均峰面积为 2 356.589 7，RSD=0.96%， 显示进 样的精密度良好。 2.7 重现性考察
2 色谱条件与结果 2.1 对照品溶液的制备
精密称取龙胆苦苷标准品 10.0 mg，加甲醇定容至 25 ml 容量瓶中，作为对照品溶液，储存备用。 2.2 供试品溶液的制备
精密称取粉碎后过筛的 10 批龙胆苦苷药材粉末各 2.5 g， 分别加入甲醇 25 ml，置超声过滤器中 ，超 声 30 min，冷 却 后 过滤，移液管各移取续滤液 1 ml 置 5 ml 容量瓶中，分别用甲 醇定容至刻度，作为供试品备用。 2.3 色谱条件的选择
表 1 样品回收率测定结果
取样量 样品中龙胆苦 对照片加 测定量 回收 平均回收 RSD 样品编号
（g） 苷含量（mg） 入量（mg） （mg） 率（%） 率（%） （%）
1
0.654 8 1.203 5 1.1246 2.251 4 99.04
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0.657 9 1.212 0 1.1246 2.245 6 99.10
龙胆为龙胆科植物以及中药材龙胆的统称。 植物龙胆 在中国大陆、俄罗斯、日本、朝鲜等均有分布，生长于海拔 400～1 700 米的地区。 中国有龙胆属 240 多 种 ，多 产 于 西 南 高山地区，北京周边只有少数的几种，龙胆更是重要的药用 植物，其根和根茎入药具有清热、泻肝、定惊等功效。 《中华 人 民 共 和 国 药 典 》2005 版 记 录 ，龙 胆 的 干 燥 根 及 根 茎 ，具 有 清热燥湿、泻肝胆火之功效，龙胆的药用历史悠久，历代本 草 均 有 记 载 ，是 常 用 的 苦 寒 健 胃 保 肝药 物[1]。 研 究 表 明 龙 胆 苦苷为其主要的活性成分，具有保肝、利胆、健胃、抗炎以及 抗菌等功效，因此，为了更好的控制药品的质量，笔者采用 高效液相色谱法测定龙胆中龙胆苦苷的含量， 以期为该药 材有效成分的含量测定提供更好的鉴定方法， 现将结果报 道如下： 1 仪器与试剂 1.1 仪器
Agrilent 1100 高效液相色谱仪，紫外光谱检测器，Agilent 1100 色谱工作站，C18 色谱柱（Techpshere ODS C18，250×4.6 mm， 5 μm），Agrilent 进样瓶，分析天平（美国梅 特 勒 有 限 公 司 ，精 密度 0.001）。 1.2 试剂
甲醇（北京北化精细化学有限责任公司，批号20081116，分 析纯），甲醇（北京北化精细化学有限责任公司，批号20081201， 色 谱 纯 ），水 （娃 哈 哈 纯 净 水 ），龙 胆 苦 苷 对 照 片 （中 国 药 品 生 物制品检定所，批号 20071203），10 批龙胆药材（分别各粉碎 后过 5 号筛，后置 50℃的干燥烘箱中干燥至恒重）。
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以完全分开。 本实验还对超声时间作了对比 ，分别采用 20、 30、40 min 对龙胆苦苷的提取率进行比较，结果，采用超声时 间为 30 min 时的提取率与 40 min 的提取率相同， 因此实验 确定了超声提取时间为 30 min[3]。
在选择检查波长时， 笔者取样品在 200～375 nm 的波长 范围内进行扫描， 结果在 270 nm 波长处龙胆苦苷有最大吸 收，因此实验过程中选择 270 nm 作为本次监测实验的波长。 龙胆苦苷的含量测定方法相关的文献已经有报道[4-6]。 本文建 立的高效液相色谱方法用于对中药龙胆中龙胆苦苷进行含 量测定，经对对照品和供试品的制备方法的考察、测定条件 的选择、线性关系的考察、精密度测定、重现性考察、回收率 的测定、稳定性试验等方法学的考察，确定了正确的含量测 定 方 法 [7-8]。
该方法的重现性、精密度以及分离度均符合规定，并且 测定方法稳定，经过对样品检测数据的反复考察结果，确定 了高效液相色谱法用于中药龙胆中有效成分龙胆苦苷含量 测 定 的 可 行 性 ，具 有 可 应 用 性 [9]。
[参考文献]
[1] 李馨,王金宏,金迪,等.HPLC 法测定龙胆中龙胆苦苷的含量[J].黑龙江 医 药 ,2010,23(3):319-321.
[关键词] 高效液相色谱法；龙胆；龙胆苦苷；含量测定
[中图分类号] R927.2
[文献标识码] A
[文章编号] 1674-4721（2011）01（c）-011－02
Determination of Gentiopicrin in Gentian by HPLC
LIU Shaowen （Traditional Chinese Medicine Hospital of Foshan City, Guangdong Province, Foshan 528000, China ） [Abstract] Objective: To establish a HPLC method for the Gentiopicroside gentian chromatographic. Methods: Used HPLC method, in which column was Techpshere ODS C18(250×4.6 mm, 5 μm), (mobile phase:methanol:water＝25:75), flow rate: 1.0 ml/L; detection wavelength:270 nm; injection volume: 5.0 μl, Nm. Results: Gentiopicrin 0.2～1.0 mg/ml good linear relationship between the linear regression equation was Y＝304.95X-17.886,r＝0.9997; measured gentian recovery Gentiopicroside was 99.12%, RSD was 1.01%. Conclusion: The method is simple, and good separation, detection sensitivity, reproducibility, and can be used to determine the content of gentian gentiopicroside detection method. [Key words] HPLC; Gentian; Gentiopicrin;Content determination
[4] 国家药典委员会.中国药典[M].部.北京:化学工业出版社,2005:64. [5] 王臣,邢秀芳,马力祥,等.栽培条叶龙胆各形态类型龙胆苦苷含量的测
定[J]. 中 国 中 药 杂 志,2004,29(9):841. [6] 黄 铭 涛,许 波,田 颂 九.HPLC 法 测 定 肝 胃 气 痛 胶 囊 中 龙 胆 苦 苷 的 含 量
取 1 号龙胆样品，按照供试品溶液的制备方法平行制备 6 份 供 试 品 溶 液 ，各 取 5.0 μl 注入 高 效 液 相 色 谱 仪 ，测 得 龙 胆苦苷的 RSD=1.29%。 2.8 加样回收实验
取相同的龙胆药材粗粉 5 份，分别加入等量的龙胆苦苷 对 照 品 ，按 照 对 照 品 溶液 的 制 备 方 法 制 备 溶 液 ，各 取 5.0 μl 进 样 。 测 得 龙 胆 苦 苷 的 平 均 加 样 回 收 率 为 99.28% ，RSD= 1.01%。 结果见表 1。