黄酮体外抗氧化活性研究

1. 供试液的制备：将纯化后的黄酮用蒸馏水（可加SDS 促溶）稀释后，分别配
制10、20、30、40、50、60、70 μg/mL 溶液，4℃保存备用。

（根据实际情况调整浓度）
2. 总黄酮的测定：
标准曲线的绘制：称取芦丁10.00 mg 至50 mL 容量瓶，加60%乙醇使之溶解定容至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液（0.2 mg/mL ）。

准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、1.25、1.5、2.0 mL （相当于芦丁0、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4 mg ），并用相应60%乙醇溶液相应补足2.0 mL ，移入10 mL 刻度比色管中，加5%亚硝酸钠溶液0.2 mL ，振摇后放置6 min ，加入10%硝酸铝溶液0.2 mL 摇匀后放置6 min ，加1.0 mol/L 氢氧化钠溶液2.0 mL 。

摇匀，放置15 min ，于510 nm 波长处测定吸光度，以芦丁含量（mg ）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定：吸取适当稀释的待测液2.0 mL ，按标准曲线制备操作步骤于
510nm 处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。

结果计算：根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮含量：
10010
3121⨯⨯⨯⨯=V m V m X 式中：X ——样品中总黄酮含量，g/100g ；
m 1——根据标准曲线计算出待测液中黄酮的量，mg ；
m ——样品质量，g ；
V 1——样品提取液测定用体积，mL ；
V 2——样品提取液总体积，mL 。

3. 还原能力的测定：
于试管中加入1.0 mL 样液(不同质量浓度的待测物溶液)或蒸馏水，再分别加入1.0 mL 磷酸缓冲溶液（0.2 mol/L, pH6.6）及1.0 mL 铁氰化钾水溶液(1%)，50℃水浴20 min 后取出快速冷却，加入1.0 mL 三氯乙酸水溶液(10%)，摇匀，5000 rpm/min 离心5 min 。

取1.0 mL 上清液，依次加入1.0 mL 蒸馏水，0.5 mL 三氯化铁水溶液(0.1%)，充分混匀，10 min 后，在700 nm 波长处测定吸光度，吸光度越大，则说明还原能力越强。

以V C 为阳性对照做参照实验。

4. DPPH 自由基清除活性：
D PPH 溶液：称取8.00 mg DPPH 用100 mL 无水乙醇溶解，定容于100 mL 容量瓶中，摇匀，倒入棕色磨口瓶，作为储备液保存于4℃冰箱中，浓度为2×10-4 mol/L 。

取100 μl 待测液及100 μl 的2×10-4 mol/L DPPH 溶液加入96孔板中，摇匀。

20 min 后用相应溶剂作参比在517 nm 下测定其吸光度A i ，同时测定2×10-4 mol/L
DPPH 溶液与等体积相应溶剂混合液的吸光度A c ，以及待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度A j 。

以V C 为阳性对照，做参照实验。

根据以下公式计算清除率：
100)1(⨯--=c j
i A A A Y
A i ——待测液与等体积DPPH 溶液混合液的OD 值
A j ——待测液与等体积无水乙醇混合液的OD 值
A c ——DPPH 溶液与等体积相应溶剂混合液的OD 值
5. ·OH 清除率的测定方法：
采用Fenton 体系测定。

取浓度为5.0 mmol/L 的邻二氮菲溶液0.5 mL ，加入浓度为150 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4) 1.0 mL ，混匀后加入浓度为 5.0 mmol/L 的FeSO4 溶液0.5 mL ，充分混匀，加入样品液1.0 mL ，0.2 mL 体积分数0.1% H 2O 2，摇匀，37℃保温60 min ，在508 nm 处测定吸光度(A s )。

按照上述操作，用蒸馏水代替样品液，测定得A 1，用蒸馏水代替样品液和H 2O 2溶液，测定得A 0。

以V C 代替待测液重复以上步骤做参照实验。

计算待测液对羟自由基的清除率Y 。

100)(01⨯--=s
s A A A A Y 6. 超氧阴离子自由基（O 2-·）清除能力的测定：（本法不适用于甲醇或乙醇作
为溶剂的样品，水溶性差的可用十二烷基磺酸钠SDS 作为溶剂）
采用邻苯三酚自氧化法测定。

取浓度为0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.3，内含2 mmol/L EDTA) 2.0 mL ，超纯水1.0 mL ，于25℃保温20 min 后加入预热过的60 mmol/L 的邻苯三酚0.1 mL(以10 mmol/L HCl 溶液配制，空白对照管中以10 mmol/L HCl 溶液代替邻苯三酚溶液)，迅速摇匀倒入比色杯，在319 nm 波长处每隔30 s 测一次，测定启动后4 min 内邻苯三酚自氧化的速率，记作△A 0。

加入1.0 mL 样品液，相应减少同体积水，测定启动后4 min 内样品抑制邻苯三酚自氧化的速率△A S 。

以V C 代替待测液重复以上步骤做参照实验。

超氧阴离子自由基清除率计算如下式：
100)1(0
⨯∆∆-=A A Y S 7. 总抗氧化力测定：采用南京建成生物工程研究所试剂盒。

样品吸光度测定在520 nm 。

一个总抗氧化力单位定义为37℃时每毫升待测液每分钟增加0.01吸光度。