微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。
生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。
将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。
注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
土壤微生物量碳测定方法(精编文档).doc
【最新整理，下载后即可编辑】土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass ）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。
近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。
由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。
测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI ）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE ）。
熏蒸提取法（FE 法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。
Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol ·L -1K 2SO 4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。
Vance 等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol ·L -1K 2SO 4提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数K EC (取值0.38)来计算土壤微生物碳。
Wu 等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。
该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。
林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。
对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的研究。
测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C 底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP 法及底物诱导呼吸法比较）。
微生物量碳氮测定方法
微生物量碳氮测定（赵宁宁版）氯仿熏蒸提取法CFE（Chloroform fumigations extractions-Method）Literature:Brookes PC, Landman A, Pruden G, Jenkinson DS (1985). Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: Arapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil. Soil Biology & Biochemistry 17: 837-842.试剂处理：1.氯仿必须是除去乙醇的，乙醇除去方法是先加入约200l的氯仿至1L的分液漏斗中，然后用5% v/v H2SO4溶液20ml洗涤两次，每次手摇动2-3min左右。
之后在用蒸馏水洗涤2-3次，然后加入5g左右的无水硫酸镁或者无水氯化钙干燥，最后使用旋转蒸发仪蒸馏。
2.沸石处理：玻璃珠事先用丙酮洗净，然后在105度下烘干。
使用清洗烘干后的玻璃珠，否则氯仿有可能不会沸腾。
上述处理均在通风橱里操作。
3.检查真空干燥器的气密性，事先使用真空泵抽取真空，待一天后轻微打开干燥器的开关，听到是否有呲呲的声音。
若是气密性不好，使用少些凡士林密封。
步骤：1.鲜土样过2mm筛子后，在40C冷藏室贮藏。
2.在熏蒸提取之前，测定土壤重量含水量，之后用蒸馏水调节土壤水分含量至统一（一般是调节到土壤的最大持水量或者调节至土壤样品中含水量最高值），这是为了保证熏蒸效果一致。
3.称取15g新鲜土样到50ml的小烧杯中（标签要用铅笔记录）。
4.将氯仿，真空干燥器事先放入通风橱中（氯仿有毒），在真空干燥器底部放入平底100ml或者200ml烧杯，烧杯中加入用丙酮洗净烘干的玻璃珠至小半杯即可，然后加入处理完毕的氯仿至2/3左右。
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样 6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。
生物量碳氮测定方法
生物量碳氮测定方法
熏蒸提取法首先需要标定氯仿和浓硝酸的用量。
氯仿用于提取生物样品中的有机碳，而硝酸用于氧化有机物质并释放出氮。
实验过程中，首先将称量好的生物样品放入一个带有砂浴和回流装置的烧瓶中，并加入适量的硝酸和氯仿。
然后，用火焰加热烧瓶，使溶液进行蒸发和浓缩。
随着溶液的蒸发，有机物质被转化为气体，并被冷凝在装有冷冻剂的收集瓶中。
在冷凝过程中，氯仿中的有机碳会沉积在冷凝瓶底部。
完成冷凝后，将氯仿从冷凝瓶中转移到预先称量的烧瓶中，然后再进行蒸发和浓缩，直到氯仿蒸发殆尽。
最后，将烧瓶中残余的有机物质转移到燃烧船中，放入燃烧炉中进行燃烧。
燃烧后，生成的CO2和N2通过吸收器中的饱和硫酸被捕获，并被转移到室外的装有碱液的收集瓶中。
碱液中的CO2被氢氧化钠中和，并转化为氢氧化钠。
通过在吸收瓶中加入酚酞指示剂，可以测定CO2的体积。
测定氮的过程与测定碳类似，只是在蒸发过程中释放的气体被洗涤瓶中的含硼酸溶液捕集。
然后将含硼酸溶液转移至定容瓶中，用碱液进行中和，再用氯化亚铁标准溶液滴定，从而可以测定氮的含量。
通过测定生物样品中CO2和N2的体积，以及标定剂量和无机碳和氮的含量，可以计算出生物样品中的有机碳和氮的含量。
总的来说，熏蒸提取法是一种通过加热蒸发和燃烧的方法，将生物样品中的有机物质转化为气体或溶液，并通过捕集和测定气体体积的方式，来测定生物体内的碳和氮含量。
微生物量碳氮
微生物量碳方法一 每个土样称取相当于 20g 烘干土重的 6 份新鲜湿土于100ml 烧杯中，其中三份作为对照，直接用 100ml 0.5 mol·L -1 K 2SO 4（87.13g 定容到1L ）浸提。
另三份放入干燥器中熏蒸，干燥器底部放适量水（保湿）和三个 50ml 小烧杯，一个烧杯盛 25ml 1% NaOH 溶液（1g NaOH 加入99ml 水），另两个各盛 25ml 无醇氯仿（投入少量沸石）。
盖严干燥器盖，将干燥器置于通风橱内，抽真空，直至氯仿沸腾约 2min ，而后置于25℃暗室中 24h ，取出盛氯仿的小烧杯，盖严干燥器盖，反复抽真空以除去残余的氯仿。
采用灭菌－提取法，从干燥器中取出土样，同对照一样放入150ml 三角瓶中，分别加入100ml 0.5 mol·L -1 K 2SO 4溶液，25℃下在往复式震荡机上振荡30min ，过滤。
滤液用德国产TOC 仪测定土壤提取液全碳含量，以熏蒸和未熏蒸土壤提取液全碳含量的差值Fc 乘以系数2.64得到土壤微生物碳的含量，计算公式为：mic C F K F 2.64=⨯=⨯C CF K F 2.64=⨯=⨯方法二 一、基本原理熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4溶液可提取成分（Joergensen,1996）。
采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数KEC 来估计土壤微生物碳。
二、试剂配制（1）硫酸钾提取剂（0.5 mol•L -1）：取871.25 g 分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10 L 。
（2）0.2 mol•L -1（1/6 K 2Cr 2O 7）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2Cr 2O 7（分析纯）9.806 g 于1 L 大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1 L 。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
土壤微生物量碳氮测定方法
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪一、方法原理土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。
1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。
2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。
直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。
直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。
现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。
本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。
二、主要仪器振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。
二、试剂1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。
将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。
2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57 g分析纯K2SO4 定溶至1 L。
四、操作步骤称取过2 mm筛的新鲜土样12.5 g六份，置于小烧杯中。
将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。
抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。
熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。
另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。
将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50 mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30 min，过滤。
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳一、实验原理：用氯仿杀死土壤中的微生物，并接种新的土壤，培养微生物使之释放二氧化碳。
测量一定时间内熏蒸土壤与为熏蒸土壤中微生物释放的二氧化碳量来估算土壤中微生物的生物量碳。
二、实验步骤：1.氯仿去乙醇。
用锡箔纸包裹分液漏斗（纵向留出一条细缝，以便观察分层情况）。
向分液漏斗中加入氯仿和氯仿一半体积的蒸馏水，盖上分液漏斗的盖子，上下摇晃数次。
静置片刻，放出分液漏斗下层的氯仿。
2.抽气。
用细筛筛选250g土壤于500mL烧杯中，并将烧杯至于干燥器中。
干燥器内放入盛有少量蒸馏水的小烧杯。
另取100mL干燥的烧杯一个，向其中加入50mL去乙醇氯仿和干燥的玻璃珠（防止氯仿爆沸，且要铺满整个烧杯底部）后，将之放入干燥器中。
在盖子内侧贴上一条蒸馏水润湿的滤纸条。
盖好干燥器的盖子，用真空泵抽气至氯仿沸腾，关闭干燥器的活塞。
把干燥器放入遮光恒温（25℃）的条件下培养24小时。
3.排出氯仿。
取出干燥器内的氯仿和湿润的滤纸条，在次抽气三分钟后打开盖子散发土壤中的氯仿，如此连续反复三次，就能排出土壤中的氯仿。
4.另筛取250g土壤，不熏蒸。
分别在熏蒸土壤和未熏蒸土壤中加入1g新鲜土壤且充分混匀。
调节土壤水分至罪大含水量的55％。
将两份土壤各放入一个未放干燥剂的干燥器中。
在干燥器中放入盛有20mL蒸馏水的烧杯盛有100mL 1mol/L NaOH溶液，盖好盖子，培养十天。
5.滴定。
取出NaOH溶液，取25mL于250mL容量瓶中，定溶。
从容量瓶中取出20mL于150mL三角瓶中，用1mol/L的HCl溶液调节Ph至10。
再用0.05mol/L的HCl溶液滴定至Ph为8.3，继续滴定至Ph为3.7，记录Ph从8.3到3.7所消耗HCl溶液的体积。
.三、计算K YX B -=土壤微生物生物量碳其中，X为熏蒸土壤释放的CO2量，Y为未熏蒸土壤释放的CO2量，由滴定所消耗的HCl溶液的体积计算得出。
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法熏蒸提取法是一种常用的微生物碳氮测定方法，主要用于土壤、沉积物和水体等环境样品中微生物碳氮的测定。
该方法的原理是通过熏蒸操作将样品中的微生物碳氮转化为气态的有机碳和氨氮，然后采用适当的仪器进行测定。
熏蒸提取法的操作步骤如下：1.制备样品：首先需要将待测样品进行适当处理，例如将土壤样品通过筛网筛分细粒土壤，去除杂质并获得均匀的样品。
2.准备熏蒸试剂：通常采用硝酸钠和过氧化氢作为熏蒸试剂。
将一定量的硝酸钠和过氧化氢溶解在适量的蒸馏水中，制备成一定浓度的熏蒸试剂。
3.装填样品：将经过处理的样品装填入适当的装填容器中，容器的底部通常需要加入一层石蜡以防止样品颗粒溢出。
4.装置熏蒸装置：将装填好样品的容器放入熏蒸装置中，使其与熏蒸试剂充分接触，并保证装置的密封性。
5.熏蒸操作：打开熏蒸装置，让熏蒸试剂蒸气渗透到样品中。
通常可以通过加热和搅拌等方法加快熏蒸的速度。
6.采样：在一定时间的熏蒸后，关闭熏蒸装置，将装填容器取出。
此时，样品中的微生物碳氮已经转化为气态的有机碳和氨氮。
可以通过适当的方法（例如吸附管）采样气相中的有机碳和氨氮。
7.测定：采集好的气相样品可以通过气相色谱、气相质谱等方法进行测定。
有机碳和氨氮的含量可以通过标准曲线或其他相关方法得到。
熏蒸提取法在微生物碳氮测定中具有一定的优点和适用性：1.简便快捷：相对于其他常用的微生物碳氮测定方法，熏蒸提取法操作简单，只需经过几个基本步骤即可得到气相样品。
2.高效准确：熏蒸提取法可以将样品中的微生物碳氮充分转化为气态，提高了测定效率和准确性。
3.适用范围广：熏蒸提取法可以应用于多种环境样品的微生物碳氮测定，如土壤、沉积物和水体等。
4.可检测多种有机碳和氨氮：通过熏蒸提取法得到的气相样品中可以同时测定多种有机碳和氨氮的含量，使分析更加全面。
当然，熏蒸提取法也存在一些局限性：1.适用样品有限：由于熏蒸提取法需要样品能够充分接触熏蒸试剂，对于一些粘稠或颗粒较大的样品，可能会影响熏蒸的效果。
土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法-全国土壤质量标准化技术委员会
《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》Determination of soil microbial biomass ‒Fumigation-extraction method国家标准（征求意见稿）编制说明《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》编制组二0一七年四月项目名称：土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法计划编号：20153803-T-326项目负责单位：中国科学院亚热带农业生态研究所项目负责人：吴金水技术委员会：全国土壤质量标准化技术委员会（SAC/TC 404）目录1、立项背景 (1)1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大 (1)1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要 (1)2、任务来源 (3)3、标准制定的原则和依据 (3)3.1 原则 (3)3.2确定依据 (4)4、标准制定的主要技术内容及方法应用评价 (4)4.1 适用范围 (4)4.2 总体框架和主要内容 (4)4.3熏蒸和提取 (5)4.4 提取物中碳的测定 (6)4.5 方法的评价 (8)4.6方法的应用 (9)5、与现行法律、法规、标准的协调性 (11)6、对标准贯彻的建议 (11)7、参考文献 (11)1、立项背景1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大土壤微生物生物量（soil microbial biomass）是指体积小于5×103μm3活体微生物总量，但不包括活的植物体，如植物根系等（吴金水等，2006；李振高等，2008）。
土壤微生物生物量虽然只占土壤有机质的3%左右，但在有机物质、氮、磷、硫等转化和循环过程中起着关键的作用，不仅是土壤有机质中最活跃的组分，而且可作为土壤养分的储存库，是植物生长吸收利用养分的重要来源，与单个微生物个体数量指标相比，更能反映微生物在土壤中的实际数量与作用潜力。
据估计植物吸收N、P、S 的60%，47%和28%分别来自微生物生物量N、P和S。
微生物是土壤中最为活跃的生命体之一，土壤微生物是土壤有机质和土壤养分( C, N, P, S 等) 循环转化的驱动力，参与有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化与循环等各个生物化学过程（林先贵，2010）。
微生物量碳的测定方法
氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳一、采样与样品预处理土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。
采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。
如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。
过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。
预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。
土壤田间持水量采用改进的Shaw（1958）方法测定。
在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗用玻璃纤维堵塞。
取50.00 g土壤于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50 ml水，保持30 min，再打开夹子使多余的水流入量筒，30 min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量，用烘干土壤质量表示。
——林启美老师文件内容二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。
浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。
此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。
2、仪器及设备培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。
3、试剂1.无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[ϕ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。
再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。
得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。
（试剂浓硫酸ϕ(H2SO4)=95~98% ，稀释19倍）2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1]: 称取硫酸钾（K2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于去离子水中，稀释至1L。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)汇总
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法work Information Technology Company.2020YEAR二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法1．主题内容与适用范围本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。
2．方法提要土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K2SO4溶液浸提，提取液一部分用K2CrO7（重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。
3．提取液的制备3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量：0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜3.2试剂的制备：0.5 M K2SO4溶液（化学纯）、无醇氯仿（提纯方法：用1N H2SO4溶液与氯仿(CHCl3三氯甲烷)按体积比2:1于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存）3.3分析步骤：3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。
在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。
放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。
包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。
到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。
另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。
3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。
用注射器注入每瓶50ml 0.5M K2SO4溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。
土壤微生物生物量的测定(滴定法)
土壤微生物生物量(碳、氮）的测定(滴定法)一、实验目的和内容土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5～10μm3活的微生物总量，是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。
耕地表层土壤中，土壤微生物量碳（Bc）一般占土壤有机碳总量的3％左右，其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化，并可以反映土壤污染的程度。
近30年来，国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究，但由于土壤微生物的多样性和复杂性，还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。
目前广泛应用的方法包括：氯仿熏蒸培养法（FI）、氯仿熏蒸浸提法（FE）、基质诱导呼吸法（SIR）、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷（ATP）法。
氯仿熏蒸浸提法（FE）的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。
二、实验材料和用具仪器：培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机（速率200次每min）；1L广口玻璃瓶；定量滤纸；紫外分光光度计；LNK-872型消煮炉（江苏省宜兴市科教仪器研究所）试剂：1.无乙醇氯仿：市售的氯仿都含有乙醇（作为稳定剂），使用前必须除去乙醇。
方法为：量取500ml氯仿于1000ml 分液漏斗中，加入50ml硫酸溶液[ρ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行3次。
再加入50ml去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。
将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。
2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。
最后定容至1L；3.重铬酸钾[c(1/6 K2Cr2O7)=0.4000mol·L-1]：称取经130℃烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于1000ml去离子水中；4.邻啡罗啉亚铁指示剂：称取邻啡罗啉（C12H8N2H2O，分析纯）1.49g，溶于含有0.70gFeSO4·7H2O的100ml 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中；5.硫酸亚铁溶液[c（FeSO4·7H2O）＝0.0667mol·L-1]：称取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O，化学纯）18.52g，溶解于600ml～800ml去离子水中，加浓硫酸（化学纯）15ml，搅拌均匀，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。
微生物量N的测量
土壤微生物量N的测定一、实验原理氯仿熏蒸浸提法的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量氮二、试剂与仪器1. 试剂无乙醇氯仿、蒸馏水、0.15mol/L K2SO42.仪器可抽气干燥器、紫外可见分光光度计三、实验步骤1.取样在一片区域内，找五株植株分别取样，每株取三份土样，以20cm深为一个单位，分三次取样，取样深度为60cm，作为一份土样。
以此，取样45份。
2. 预培养常温下，保持水分通气培养10d。
预培养的目的是为了减少熏蒸后培养期间有机氮矿化的干扰,减少采样时土壤水分和温度的差异,使各土壤测定结果有可比性。
3. 土壤样品熏蒸每个土样各称取6.000g，12份分别置入25mL小瓶中,6份熏蒸,6份不熏蒸。
将欲熏蒸土样置于内径29cm可抽气的干燥器内隔板上,干燥器底部放置装有30mL无乙醇氯仿的100mL烧杯,并另外放置1个装有蒸馏水的小烧杯,使熏蒸时土壤含水量不变。
随之抽气,直到氯仿出现气泡沸腾后持续5min,停止抽气,紧接着密闭干燥器,并将其置于室温(与黑暗处。
24h后取出土样,在通气良好的地方放置2~3h,使残留土壤中的氯仿尽可能挥发。
不熏蒸的土样置于另一干燥器中,用蒸馏水代替氯仿,与用氯仿熏蒸一样处理,作为不熏蒸对照。
3. 熏蒸-280nm紫外比色法另取3份熏蒸和3份未熏蒸的土样,转入100mL三角瓶中,加50mL0.15mol/LK2SO4,振荡30 min后,过滤,立即在280nm 紫外光下测定吸光度。
熏蒸和未熏蒸作相同处理。
用单位土中的吸光度增量表示,即:v/g,烘干土=(abs熏/G熏)-(abs未/G未),其中:abs代表280nm紫外光下的吸光度,G代表称的土重相当的烘干土重。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
work Information Technology Company.2020YEAR
二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法
1．主题内容与适用范围
本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和
微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。
2．方法提要
土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K2SO4溶液浸提，提取液一部分用K2CrO7（重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。
3．提取液的制备
3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析
天平（感量：0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、
大三角瓶（150ml）、40C的冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、
保鲜膜
3.2试剂的制备：0.5 M K2SO4溶液（化学纯）、
无醇氯仿（提纯方法：用1N H2SO4溶液与氯仿(CHCl3三氯甲烷)按体积比2:1于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代
替硫酸与氯仿2:1混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入
到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存）
3.3分析步骤：
3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。
在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。
放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。
包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。
到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。
另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。
3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。
用注射器注入每瓶50ml 0.5M K2SO4溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。
如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。
4．生物量碳的测定—K2CrO7氧化法
4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、
1500W电炉两个、变压器两个、滴定管（25ml）
4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K2CrO7
标准溶液
邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K2CrO7溶液（19.6125g/L，分析纯）
0.02M (NH4)2Fe(SO4)2溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸
（98%，分析纯）酸化，而后定容至1L、
4.3分析步骤：
4.3.1吸取2ml 0.4 N K2CrO7溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加
入等量的玻璃球（约一小药匙，10个）。
吸取步骤（3.2.2）中的过滤液
8~10ml（根据含碳量多少而定），放入到电炉上，安装好冷凝系统，调压至
130伏开始加热。
从玻璃球沸腾时开始记时，保持沸腾30分钟，其间应摇匀两次。
在30分钟到前2分钟关上电炉，利用余热保持沸腾至30分钟，随后从冷
凝管上口加入20ml蒸馏水，清洗冷凝管壁，降低沸瓶温度。
4.3.2 取下沸瓶，待冷却至室温，加入2~3滴指示剂，用准确标定过的
(NH4)2Fe(SO4)2溶液滴定。
颜色从黄色→深绿色→天蓝色→浅灰色（很短暂）→
红棕色到终点。
同时用0.5M K2SO4代替过滤液作空白，注意两个电炉间的差
异。
注：(NH4)2Fe(SO4)2溶液的标定：在三角瓶内放入0.1000 N K2CrO7标准溶液
10ml，加入混合酸15ml，摇匀冷却，用(NH4)2Fe(SO4)2溶液滴定，颜色反应同
上。
一般在测定开始和结束时各标定一次，取平均值，保留4位小数。
4.4分析结果的表述：
计算公式：（1）C（ug/ml）=[(V空白—V样品)*N(NH4)2Fe(SO4)2*3*1000]/吸取样品的
体积数(ml)
（2）C（ug/g）=[C(ug/ml)*提取液的总体积数(ml)]/W
干土
(g)
（3）EC（ug/g）=C
熏蒸（ug/g）—C
未熏蒸
（ug/g）
（4）微生物量碳BC（ug/g）=EC/0.38（ug/g）
4.5允许差
4.5.1取平行测定结果的算术平均值作为测定结果（一般做两次重复）。
4.5.2平行测定的绝对差值≤10ug/g。
（要求样品滴定时的绝对差值≤0.1ml）5．微生物量氮的测定—消煮、碱化蒸馏法
5.1仪器、设备：定氮仪、烘箱、开氏瓶（50ml）、移液管（50ml、2ml、
5ml）、小漏斗、小三角瓶（150ml）
5.2试剂的制备：去离子水、浓硫酸（化学纯）、硼酸指示剂、10M NaOH溶液
（化学纯）、CuSO4溶液
5.3分析步骤：
5.3.1 吸取步骤3.2.2中的过滤液25-30ml放入到开氏瓶（三角瓶）中，加入
2ml浓硫酸（固定滤液中的氨）。
放入到烘箱中在60~700C烘2~3天，直至瓶内还剩下3ml左右溶液，取出。
加入3ml浓硫酸和1ml0.19MCuSO4溶液，放上小漏斗在电炉上消煮。
消至瓶内颜色呈天蓝色为止，取下冷却。
同时用0.5N K2SO4溶液50ml代替滤液作空白。
5.3.2 用去离子水洗清小漏斗内外壁，少量多次冲洗开氏瓶，将开氏瓶中的液体全部转移到定氮仪中，加入20ml 10N NaOH溶液进行碱化蒸馏，冷凝管下口放装有5ml硼酸指示剂的小三角瓶，接收蒸馏液，待蒸馏液达到60ml时停止蒸馏。
蒸馏前应检查蒸馏装置是否漏气，并进行空蒸馏清洗管道。
5.3.3 用0.02N硫酸标准溶液滴定馏出液，加入指示剂，颜色由蓝色刚变成紫红色为终点，记录消耗硫酸标液的体积。
5.4分析结果的表述：
计算公式：N （ug/g）=[(V—V0)*N H2SO4*14.0*稀释倍数*1000*2.22]/W烘干土微生物量氮BN（ug/g）=N熏蒸—N未熏蒸
其中： V ：滴定样品所消耗的硫酸数，ml；
V0：滴定空白所消耗的硫酸数，ml；
稀释倍数：总过滤液是所吸取的过滤液的倍数，；
2.22：无机氮转化为有机氮的转化系数。
5.5允许差
5.5.1取平行测定结果的算术平均值作为测定结果（一般做两次重复）。
5.5.2平行测定的绝对差值≤5ug/g。
（要求样品滴定时的绝对差值≤0.05ml ）。