高活性蛋白酶乳酸菌的筛选

深圳大学综合性、设计性与探索研究性实验

课程名称：微生物学实验

实验项目名称：高活性蛋白酶乳酸菌的筛选

学院：生命科学学院

专业：生物科学

指导教师：韩庆国

报告人：魏高斌学号： 2011300161 班级： 5 实验时间：2013-12-14~2013-12-31

实验报告提交时间：2014-01-03

高活性蛋白酶乳酸菌的筛选

[摘要]本实验利用添加了碳酸钙的改良乳酸菌的固体培养基通过初筛、复筛，火腿肠中得到一种能分解碳酸钙的菌种，对该菌种进行了形态学鉴定，确定此菌株属乳酸菌的乳酸球菌属。通过单因变量的改变，不断筛选分离得到高蛋白酶活性的乳酸菌种。

[关键词]乳酸菌、筛选、蛋白酶；

乳酸菌具有多种生理功能，乳酸菌具有提高食品营养价值，改善食品风味，延长保存时间，对人体具有多方面的保健作用，如能调节肠道菌群，维持体内微生态平衡，抑制肠道内腐败菌生长繁殖，消除体内有毒物质的产生，改善便秘，降低胆固醇水平，改善肝功能，缓解乳糖不耐症，改善维生素代谢，增强免疫，抗肿瘤，抗突变等，在畜牧业方面，乳酸菌还有增膘作用等，引起了人们广泛的研究兴趣，本文利用简单的培养分离纯化方法，利用单因素变量，将高蛋白酶活性的乳酸菌从肉类制品中分离筛选出来，这类高蛋白酶菌种在食品工业或畜牧业上有一定的意义。

1.材料与方法

1.1.材料

菌种来源：市售金锣火腿肠；

试剂：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸二铵、葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、吐温-60、去离子水、琼脂、碳酸钙、结晶紫染液、碘液、番红染液、干酪素；

器材：锥形瓶、烧杯、试管、培养皿、培养皿桶、移液管、洗耳球、接种环、移液器、移液器头、超净工作台、显微镜、电炉、分析天平、高压蒸汽锅、恒温培养箱等。

1.2.培养基配方

1.2.1.改良乳酸细菌固体培养基（MRS）

蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母膏4.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温-60 1.0 ml，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g、琼脂20.0 g，碳酸钙3%，pH 6.0~6.8，加蒸馏水至1000 ml。

1.2.2.乳酸菌蛋白酶活性检测的固体培养基

蛋白胨10.0 g，牛肉膏8.0 g，酵母膏4.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温-60 1.0 ml，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g、琼脂20.0 g，0.5%干酪素，pH 6.0~6.8，加蒸馏水至1000 ml。

1.3.方法

1.3.1.改良乳酸细菌培养基（MRS）配置

在室温的条件下，按照配方用分析天平分别使用称量纸称量：蛋白胨10.0 g、牛肉膏8.0

g、酵母膏4.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁

0.2 g、硫酸锰0.05 g，使用量程为1 ml的移液管量取吐温-60 1.0 ml到1000 ml烧杯中，与以上的全部试剂混匀，加去离子水至1000 ml，在电炉上稍微加热搅拌，以助于吐温-60的溶解，以制成pH 6.0~6.8的液体培养基。分装于500ml锥形瓶中，每瓶200ml。

按配方称取琼脂4 g、碳酸钙6 g于一个锥形瓶中制备成筛选乳酸细菌的固体培养基；按配方称取琼脂4 g、干酪素1 g制备成乳酸菌蛋白酶活性检测的固体培养基；锥形瓶用干净的胶塞和报纸封口。包扎若干洁净试管，准备移液器头，培养皿，2瓶100ml去离子水，于高压蒸汽锅121℃灭菌15min后冷却至50℃待用。

1.3.

2.乳酸菌的分离和纯化

1.3.

2.1.乳酸菌的分离

在超市购买金锣火腿肠，用万分之一的天平称取10 g，在超净工作台中减碎放入装有90 ml 冷却的无菌水的150ml锥形瓶中，并充分混合均匀，即为稀释度为10-1的样品液，另取3根无菌试管，用移液管和洗耳球各加入10ml无菌水，使用无菌的1ml移液器将样品稀释至10-2、10-3、10-4，分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4样品稀释液1 ml于培养皿中，然后倒入冷却至50℃后碳酸钙MRS固体培养基摇匀，待冷却后取出倒置于恒温培养箱中37 ℃、无氧条件下培养1-2天，并将剩余培养基倒平板，待用。

1.3.

2.2.乳酸菌的纯化

从培养了1-2天的碳酸钙MRS培养基上挑取有透明圈的菌落，进行革兰氏染色，取菌种培养物常规涂片、干燥、固定，滴加结晶紫初染1-2分钟，水洗，再用碘液冲去残余水渍，并用碘液覆盖媒染约1分钟后水洗，并用滤纸吸取载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，最后用番红液复染约2分钟，水洗，待干燥后，高倍镜观察。

在超净工作台中选取革兰氏阳性菌的透明圈菌落，在倒好碳酸钙MRS固体培养基平板上划线分离，于温培养箱中37 ℃、无氧条件下培养1-2天。重复以上操作，直至得到纯菌落。培养获得的乳酸菌，通过形态分析对菌种进行鉴定。

1.3.3.乳酸菌蛋白酶活性的测定

在超净工作台下，取已纯化的乳酸菌，蛋白酶活性检测的MRS固体培养基上点接种若干个点，在保温箱里37摄氏度培养1-2天，当平板中干酪素分解时, 菌落周围会出现透明圈。

2.实验结果

2.1.乳酸菌的分离纯化及革兰氏鉴定

如图1所示，在火腿稀释度10-1浓度的碳酸钙MRS平板在37℃培养分离数日，其中有可以分解碳酸钙的菌落生长，分解碳酸钙产生透明圈，透明圈内有乳白色菌落，可初步认为此菌就是乳酸菌。

挑选透明圈中菌种进行革兰氏染色，结果呈阳性，如图2所示，菌落被染成紫色，在10×40高倍镜下观察，可观察到菌体形态呈球状，单个或链状排列，无芽孢，无荚膜，边缘光滑细腻，本实验认为此乳酸菌是乳杆菌属。

图1 乳酸菌的筛选图2革兰氏染色鉴定乳酸菌

2.2.乳酸菌的纯化

挑选透明圈内的乳酸菌落在新的碳酸钙MRS平板上划线分离，在37℃培养2day，可分离得到单个菌落的乳酸菌。