大学仪器分析教学课件(分子荧光与磷光分析法)
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分子荧光与磷光光谱分析法
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量； 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态
5.溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
2018/8/27
一、 仪器与结构流程 第二节 instrument and general 分子荧光与磷光分析法 process 二、 荧光分析法和应用 molecular fluorescence and fluorescence analysis and phosphorescence analysis application 三、 磷光分析法的应用 phosphorescence analysis and application
迁也然。
2018/8/27
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
2018/8/27
三、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
Get清风3荧光磷光 仪器分析选修课课件
➢Sharmistha Sinha, Shruti S. Bandyopadhyay, Debjani Ghosh, Udipta Ranjan Chatterjee and Sudipta Saha, et al.
➢Food Science and Biotechnology, 2021, Volume 20, Number 4, Pages 1005-1011
特点：灵敏度高，检测下限比分光光度法低 2~4个数量级。但应用范围不如分光光度法广 泛。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
3.磷光：由三线态的最低振动能级以光的形式放 出能量返回基态的各振动能级，其发光现象称为 磷光。 4.荧光与磷光的比较： 发光机制不同：单线态至单线态跃迁→荧光
三线态至单线态跃迁→磷光。 激发分子寿命：荧光→ 约10-9~10-6s
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
2、分子结构与荧光的关系 〔1〕跃迁类型： π-π、n-π弱； π-π*强光。 〔2〕共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共 轭双键脂肪烃π-π激 〔3〕分子的刚性平面：效应增加，可使荧光 效率增大。 〔4〕取代基效应： ①给电子基：荧光效率提高。 ②吸电子基：荧光减弱熄灭 ③对π电子共轭体系作用小，对F无影响
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
2.磷光与荧光比较： 磷光辐射波长比荧光长； 磷光寿命比荧光长； 磷光的寿命和辐射强度受重原子和顺磁性
离子影响较大。
3.低温磷光分析： 为减少无辐射跃迁能量损失， 保持磷光强度， 采用低温磷光分析。但制冷设备 和制冷剂昂贵，操作麻烦，需除氧。目前，仪器 已有很大改进。
(五) 分子荧光及磷光分析法的应用
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
➢Food Science and Biotechnology, 2021, Volume 20, Number 4, Pages 1005-1011
特点：灵敏度高，检测下限比分光光度法低 2~4个数量级。但应用范围不如分光光度法广 泛。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
3.磷光：由三线态的最低振动能级以光的形式放 出能量返回基态的各振动能级，其发光现象称为 磷光。 4.荧光与磷光的比较： 发光机制不同：单线态至单线态跃迁→荧光
三线态至单线态跃迁→磷光。 激发分子寿命：荧光→ 约10-9~10-6s
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
2、分子结构与荧光的关系 〔1〕跃迁类型： π-π、n-π弱； π-π*强光。 〔2〕共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共 轭双键脂肪烃π-π激 〔3〕分子的刚性平面：效应增加，可使荧光 效率增大。 〔4〕取代基效应： ①给电子基：荧光效率提高。 ②吸电子基：荧光减弱熄灭 ③对π电子共轭体系作用小，对F无影响
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
2.磷光与荧光比较： 磷光辐射波长比荧光长； 磷光寿命比荧光长； 磷光的寿命和辐射强度受重原子和顺磁性
离子影响较大。
3.低温磷光分析： 为减少无辐射跃迁能量损失， 保持磷光强度， 采用低温磷光分析。但制冷设备 和制冷剂昂贵，操作麻烦，需除氧。目前，仪器 已有很大改进。
(五) 分子荧光及磷光分析法的应用
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
分子荧光和磷光光谱分析法61页PPT
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
61
分子荧光和磷光光谱分析法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
大学仪器分析教学课件(分子荧光与磷光分析法)
phosphorescence analysis and application
analysis
00:36:24
一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：
单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：氙灯和高压汞灯 样品池：石英 检测器：光电倍增管。
三、磷光分析法及应用
与荧光相比，磷光具有两个特点
（1）磷光辐射的波长比荧光长
（2）磷光的寿命比荧光长
1.磷光强度与磷光物质浓度的关系
当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之 间的关系式为
Ip=2.3φpI0εbc 式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，ε磷光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程。
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7、磷光分析法的应用
磷光分析法在无机化合物的测定中应用 较少，它主要用于测定有机化合物。 (1).稠环芳烃分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和 杂环化合物（致癌物质）；见表
(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析 (3).药物分析
见表
00:36:24
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（2）胶束增稳的溶液室温磷光法 当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶
束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微 环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光 团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损 失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了 三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测 量室温磷光。
第四章 分子发光分析法
molecular luminescence
analysis
00:36:24
一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：
单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：氙灯和高压汞灯 样品池：石英 检测器：光电倍增管。
三、磷光分析法及应用
与荧光相比，磷光具有两个特点
（1）磷光辐射的波长比荧光长
（2）磷光的寿命比荧光长
1.磷光强度与磷光物质浓度的关系
当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之 间的关系式为
Ip=2.3φpI0εbc 式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，ε磷光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程。
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7、磷光分析法的应用
磷光分析法在无机化合物的测定中应用 较少，它主要用于测定有机化合物。 (1).稠环芳烃分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和 杂环化合物（致癌物质）；见表
(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析 (3).药物分析
见表
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（2）胶束增稳的溶液室温磷光法 当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶
束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微 环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光 团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损 失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了 三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测 量室温磷光。
第四章 分子发光分析法
molecular luminescence
分子荧光和分子磷光分析法
6. 紫外-可见光度法在定性分析中的应用: 了解能级跃迁的基 本类型, 共轭烯烃键数与能量的关系, 溶剂极性对吸收光 谱的影响.
7. 分子荧光与分子磷光的产生及特点, 仪器比较.
31
第9章
1. 沉淀分离类型, 提高选择性的方法 2. 溶剂萃取分离: KD、D、E 的定义与计算 3. 离子交换分离： 树脂的种类和性质、应
1
8.7.1 发光机理(Jablonski Diagram)
分子吸光与发光示意图
荧光寿命: 10－9～10－7 s 磷光寿命: 10－4～10 s
2
蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）
吸收光谱 发射光谱
激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:ex 发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:em 3
单色器与液槽之间各装一个斩波片.
应用：主要用于有机分析, 与荧光法互补.
24
室温磷光 --固体样品
低温磷光 --液体样品
低温磷光的样品装置
样品管
液氮
镀银
Io
未镀银
25
转筒式磷光镜（a）和转盘式磷光镜（b）
26
第4章
1. 平衡常数:各级形成常数Ki、不稳定常数K不、酸
的质子化常数K H、累积形成常数i ；分布系数。 络合反应的副反应系数（Y 、M 、MY）与条
15
荧光光度计光路图
电源
光度计
记录仪
光源 试样液池
光电倍增管
16
测定方法—标准曲线法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等；
3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(F), 根据工作曲线
分子发光分析荧光磷光
荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ lem
11
激发光谱和荧光光谱
1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定 荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F)，作F—l光谱 图称激发光谱。 从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长lex，选用 lex可得 到强度最大的荧光。 2. 荧光光谱：选择lex作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记 录每一波长下的 F，作 F- l 光谱图称为荧光光谱。 荧光光谱中荧光强度最强的波长为 lem。 lex 与 lem一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
42
6. 测定方法－荧光光谱的制备
①测定UV-Vis吸收光谱:分析物制成溶液，扫描获得UV-Vis光 谱。从最大吸收波长中选择λmax作为激发光波长（λex）。 ②测定荧光发射光谱 :固定激发光波长 λex(通常先试用 λmax)， 设定发射光谱范围 (通常起始波长大于 λex，再延伸 100nm左 右)，扫描获得发射光谱。从中得到最大荧光发射波长λem。
29
3). pH的影响
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对荧光强度有较大影响， 主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡的改变。
苯胺在下列哪种条件下荧光强度最强？ A pH＝1 B pH＝3 C pH＝13 D pH＝10
30
4). 荧光熄灭 （fluorescence quenching）
UV/Vis激发物质粒子 电子从基态跃迁到激发态 电子回到第一激发态的最低振动能级 电子回到基态，同时发射出荧光
7
2 荧光和磷光光谱
菲
8
核黄素的荧光光谱
λex = 445 nm
chapter5分子磷光和荧光
有不同衍射图
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
电子衍射：电子衍射是透射电子显微镜的
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1. 分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能
级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能
级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
2.电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 分子中一对电子为自旋反平行，S=0，M=1，这 种态被称为单重态或单线态，大多数有机分子 的基态处于单重态。 处于S0态的一对电子吸收光子受激后，产生了在 两平个行轨自道旋中比自成旋 方 向 平 行 的 电 子 ， 这 时 S=1 ， M对=自3，旋这稳种定状(态洪称为三重态或三线态。 特规则)，三重 态能级比相应
11. 顺磁共振波谱分析法 在外磁场的作用下，电子的自旋磁矩
与磁场相互作用而裂分为磁量子数不同的 磁能级，吸收微波辐射后产生能级跃迁， 1根2. 据旋吸光收法光谱可进行结构分析。
溶液的旋光性与分子的非对称结构有 密切关系，可利用旋光法研究某些天然产 物及配合物的立体化学问题，旋光计测定 1糖3. 的衍含射量法。 X射线衍射：研究晶体结构，不同晶体具
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
分子荧光和磷光光谱讲解ppt课件
GFP
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
Generation of Molecular Fluorescence and Phosphorescence
原理
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
荧光和磷光的产生过程
• 分子能级和跃迁
– 电子能级、振动能级和转动能级 – 基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能
级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位； – 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)； 速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
500
nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
分子产生荧光的条件
• 分子产生荧光必须具备的条件
– 具有合适的结构（强的紫外可见吸收） – 具有一定的荧光量子产率
荧光量子产率（）
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
内容(contents)
• 原理
– 分子荧光与磷光产生过程 – 激发光谱与荧光光谱 – 荧光的产生与分子结构关系 – 影响荧光强度的因素
第七章 分子发光分析法(荧光、磷光和化学发光)
2021/7/13
2
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence and phosphorescence
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快 、激发态寿命最短的途径占优势；
2021/7/13
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三、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2021/7/13
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四、影响荧光强度的因素
factors affecting fluorescence intensity
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化（极性大，荧光强）；
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
第七章 分子发光分
析法
molecular luminescence analysis
第一节 分子荧光与磷光
molecular fluorescence and phosphorescence 第二节 分子荧光与磷光
分子荧光和磷光分析法
3
荧光和磷光体系能级示意图
4
激发光谱和发射光谱
Ê 激发光谱：物质分子选择性地吸收某一波段
的光产生的光谱。激发光谱为荧光强度与激发波 长的关系曲线。
Ê 发射光谱：受激发光照射时，荧光（磷光）
物质发射的光谱。如果固定激发光波长为激发光 谱峰值所对应的波长，然后测定不同波长时所发 射的荧光（或磷光）强度，即得荧光（磷光）光 谱曲线。
定量分析关系式
If = 2.3 ϕ I0 ε l c
浓度
荧
光 量
样品池厚度
子 效
吸光系数
率 入射光强度
发射光量子数
ϕ = 吸收光量子数 ≤ 1
1) 增加入射光强度，荧光强度增加
2)
If = Kc
只有在极稀溶液中，即ε l c < 0.05，
If与c方呈线性关系
苯酚的荧光标准曲线
荧光法的灵敏度比分光光度法高2~4个数量级
荧光 样品池
发射光 单色器
检测系统
荧光光度计示意图
Ø 光源与检测器呈90度角，以避开激发 光、杂散光的干扰，增加检测灵敏度。
I0
It
If
荧光 检测器
紫外－可见 检测器
Ø样品池 四面透光
Ø 分光系统(双单色器)
激发光单色器作用：选择激发波长
发射光单色器作用：分离出荧光发射波长
荧光和磷光分析法的应用
荧光定量分析的步骤： 1)绘制激发光谱和发射光谱，根据光谱曲线确定 最大激发光波长(λex)和最大发射波长(λem)作为 工作波长。 2)确定适宜的分析条件：溶剂、试剂浓度、pH、 温度等。 3)采取工作曲线法或比率法与标准溶液的荧光强 度比较，测得未知样品中待测组分的浓度
11
荧光和磷光体系能级示意图
4
激发光谱和发射光谱
Ê 激发光谱：物质分子选择性地吸收某一波段
的光产生的光谱。激发光谱为荧光强度与激发波 长的关系曲线。
Ê 发射光谱：受激发光照射时，荧光（磷光）
物质发射的光谱。如果固定激发光波长为激发光 谱峰值所对应的波长，然后测定不同波长时所发 射的荧光（或磷光）强度，即得荧光（磷光）光 谱曲线。
定量分析关系式
If = 2.3 ϕ I0 ε l c
浓度
荧
光 量
样品池厚度
子 效
吸光系数
率 入射光强度
发射光量子数
ϕ = 吸收光量子数 ≤ 1
1) 增加入射光强度，荧光强度增加
2)
If = Kc
只有在极稀溶液中，即ε l c < 0.05，
If与c方呈线性关系
苯酚的荧光标准曲线
荧光法的灵敏度比分光光度法高2~4个数量级
荧光 样品池
发射光 单色器
检测系统
荧光光度计示意图
Ø 光源与检测器呈90度角，以避开激发 光、杂散光的干扰，增加检测灵敏度。
I0
It
If
荧光 检测器
紫外－可见 检测器
Ø样品池 四面透光
Ø 分光系统(双单色器)
激发光单色器作用：选择激发波长
发射光单色器作用：分离出荧光发射波长
荧光和磷光分析法的应用
荧光定量分析的步骤： 1)绘制激发光谱和发射光谱，根据光谱曲线确定 最大激发光波长(λex)和最大发射波长(λem)作为 工作波长。 2)确定适宜的分析条件：溶剂、试剂浓度、pH、 温度等。 3)采取工作曲线法或比率法与标准溶液的荧光强 度比较，测得未知样品中待测组分的浓度
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分子磷光和荧光优质资料课件
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辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为
S1→
S0跃迁），发射波长为
λ
’ 的荧光；而且不论电子开始
2
被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ ‘2的荧光。时间
10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
λ
‘ 2
>
λ
2
>
λ
1
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下 荧光强度的变化。以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF） 为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱 （图中曲线I ） 。
2 .化合物的结构与荧光
(1)跃迁类型
对于大多数荧光物质，首先经历π→π∗或n(非键电子轨道)→π∗ 激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再发生π∗→π或 π∗→n跃迁而得到荧光。
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
6
（2）分子光谱 基于分子中电子能级、振-转能级跃迁 紫外光谱法（UV） 红外光谱法（IR） 分子荧光光谱法（MFS） 分子磷光光谱法（MPS）
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为
S1→
S0跃迁），发射波长为
λ
’ 的荧光；而且不论电子开始
2
被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ ‘2的荧光。时间
10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
λ
‘ 2
>
λ
2
>
λ
1
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下 荧光强度的变化。以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF） 为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱 （图中曲线I ） 。
2 .化合物的结构与荧光
(1)跃迁类型
对于大多数荧光物质，首先经历π→π∗或n(非键电子轨道)→π∗ 激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再发生π∗→π或 π∗→n跃迁而得到荧光。
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
6
（2）分子光谱 基于分子中电子能级、振-转能级跃迁 紫外光谱法（UV） 红外光谱法（IR） 分子荧光光谱法（MFS） 分子磷光光谱法（MPS）
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二、荧光分析方法与应用
1. 特点
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.001g/cm-3
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
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2.定量依据与方法
(1)定量依据
当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间的 关系式为
06:当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶
束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微 环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光 团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损 失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了 三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测 量室温磷光。
If=2.3φfI0εbc 式中：φf为荧光效率，I0为激发光的强度，ε荧光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。
在一定条件下，φf、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成 If=Kc
即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。 荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液。
对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。
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6.磷光分析仪 和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光度计
上配上磷光附件后，即可用于磷光定。 （1）试样室
将试样放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于 低温磷光测定。 （2）磷光镜
有些物质同时会发生荧光和磷光，为了能在同 时有荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发 光单色器和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之 间各装一个斩波片，并由一个同步马达带动，这种 装置称作磷光镜。
在一定条件下，φp、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成：
Ip=Kc
即磷光强度与磷光物质的浓度c成正比。
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2.温度对磷光强度的影响 随着温度的降低，磷光逐渐增强 3.重原子效应 使用含有重原子的溶剂或在磷光物质中引入 重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光 强度，这种效应称作重原子效应。 4.低温磷光 用液氮作冷却剂（77K）
第四章 分子发光分析法
molecular luminescence
analysis
第二节 分子荧光与磷光分析法
molecular fluorescence and phosphorescence
一、 仪器与结构流程
instrument and general process 二、 荧光分析法和应用
fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法及应用
phosphorescence analysis and application
analysis
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一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：
单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：氙灯和高压汞灯 样品池：石英 检测器：光电倍增管。
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5.室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择 的限制，发展了以下几种室温磷光法： （1）固体表面室温磷光法 此法基于测量室温下吸附于固体基质（载 体）上的有机化合物所发射的磷光。理想的 载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或 基质中以增加刚性，并减小三重态的碰撞猝 灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷 光背景。
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内容选择
第一节 分子荧光和磷光
molecular fluorescence and phosphorescence
第二节 分子荧光和磷光分析法
molecular fluorescence and phosphorescence analysis
第三节 分子发光分析
chemiluminescence analysis 结束
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7、磷光分析法的应用
磷光分析法在无机化合物的测定中应用 较少，它主要用于测定有机化合物。 (1).稠环芳烃分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和 杂环化合物（致癌物质）；见表
(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析 (3).药物分析
见表
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三、磷光分析法及应用
与荧光相比，磷光具有两个特点
（1）磷光辐射的波长比荧光长
（2）磷光的寿命比荧光长
1.磷光强度与磷光物质浓度的关系
当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之 间的关系式为
Ip=2.3φpI0εbc 式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，ε磷光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程。
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（2）定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出未知试样的浓度； 比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
IS CS IX CX
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3.荧光分析法的应用
目前荧光分析大多用于定量分析，由于自身发射荧光 的化合物不多，因此往往利用有机试剂与荧光较弱或不显荧 光的物质结合形成发荧光的配合物来进行测定。
(1)无机化合物的分析
与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。
（2）有机化合物的分析
芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以 直接进行荧光测定；而脂肪族化合物的分子结构较简单，本 身能发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。
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二、荧光分析方法与应用
1. 特点
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.001g/cm-3
（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；
（3）试样量少 缺点：应用范围小。
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2.定量依据与方法
(1)定量依据
当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间的 关系式为
06:当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶
束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微 环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光 团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损 失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了 三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测 量室温磷光。
If=2.3φfI0εbc 式中：φf为荧光效率，I0为激发光的强度，ε荧光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。
在一定条件下，φf、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成 If=Kc
即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。 荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液。
对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。
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6.磷光分析仪 和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光度计
上配上磷光附件后，即可用于磷光定。 （1）试样室
将试样放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于 低温磷光测定。 （2）磷光镜
有些物质同时会发生荧光和磷光，为了能在同 时有荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发 光单色器和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之 间各装一个斩波片，并由一个同步马达带动，这种 装置称作磷光镜。
在一定条件下，φp、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成：
Ip=Kc
即磷光强度与磷光物质的浓度c成正比。
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2.温度对磷光强度的影响 随着温度的降低，磷光逐渐增强 3.重原子效应 使用含有重原子的溶剂或在磷光物质中引入 重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光 强度，这种效应称作重原子效应。 4.低温磷光 用液氮作冷却剂（77K）
第四章 分子发光分析法
molecular luminescence
analysis
第二节 分子荧光与磷光分析法
molecular fluorescence and phosphorescence
一、 仪器与结构流程
instrument and general process 二、 荧光分析法和应用
fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法及应用
phosphorescence analysis and application
analysis
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一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：
单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：氙灯和高压汞灯 样品池：石英 检测器：光电倍增管。
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5.室温磷光 由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择 的限制，发展了以下几种室温磷光法： （1）固体表面室温磷光法 此法基于测量室温下吸附于固体基质（载 体）上的有机化合物所发射的磷光。理想的 载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或 基质中以增加刚性，并减小三重态的碰撞猝 灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷 光背景。
06:05:03
内容选择
第一节 分子荧光和磷光
molecular fluorescence and phosphorescence
第二节 分子荧光和磷光分析法
molecular fluorescence and phosphorescence analysis
第三节 分子发光分析
chemiluminescence analysis 结束
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7、磷光分析法的应用
磷光分析法在无机化合物的测定中应用 较少，它主要用于测定有机化合物。 (1).稠环芳烃分析
采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和 杂环化合物（致癌物质）；见表
(2).农药、生物碱、植物生长激素的分析 (3).药物分析
见表
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三、磷光分析法及应用
与荧光相比，磷光具有两个特点
（1）磷光辐射的波长比荧光长
（2）磷光的寿命比荧光长
1.磷光强度与磷光物质浓度的关系
当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之 间的关系式为
Ip=2.3φpI0εbc 式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，ε磷光物质的摩尔 吸收系数，b为试样池的光程。
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（2）定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲
线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出未知试样的浓度； 比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；
IS CS IX CX
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3.荧光分析法的应用
目前荧光分析大多用于定量分析，由于自身发射荧光 的化合物不多，因此往往利用有机试剂与荧光较弱或不显荧 光的物质结合形成发荧光的配合物来进行测定。
(1)无机化合物的分析
与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。
（2）有机化合物的分析
芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以 直接进行荧光测定；而脂肪族化合物的分子结构较简单，本 身能发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。
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