结核分枝杆菌的分子生物学检测方法研究现状
结核分枝杆菌实验室检测产品和技术应用进展
目前，结核分枝杆菌检测方法主要包括菌种培养、显微镜检查、分子生物学 技术和免疫学技术等。菌种培养是诊断结核病的金标准，但培养周期长、操作繁 琐，不适用于早期快速诊断。显微镜检查可观察到痰液中结核分枝杆菌的形态， 但灵敏度较低。分子生物学技术如聚合酶链反应（PCR）等具有高灵敏度、快速 等优点，但设备昂贵、操作复杂。免疫学技术如酶联免疫吸附试验（ELISA）等 具有良好的特异性，但易受交叉反应影响。
3、代谢热谱技术代谢热谱技术是一种通过测定样品代谢过程中产生的热量， 实现对目标分子检测的方法。近期，有研究团队利用代谢热谱技术成功检测出结 核分枝杆菌，并初步探讨了不同菌种对热谱的影响。该方法具有无损、快速等优 点，有望为结核病的早期诊断和耐药性分析提供新途径。
三、结论
结核分枝杆菌快速检测方法在近年来取得了显著进展，但仍存在不足之处。 现有的方法在灵敏度、特异性、操作简便性和成本等方面仍需进一步优化。为了 有效控制结核病传播，未来的研究应着重以下几个方面：
3.市场应用前景和政策因素对技 术发展的影响
随着全球结核病疫情的加剧和对结核病诊断与治疗的需求增加，预计未来将 有更多的创新技术在结核分枝杆菌实验室检测领域得到应用和推广。此外，政策 因素也将对技术的发展和应用产生重要影响，如政府对相关研究和开发的支持、 对新技术的引进和推广的政策倾斜等。
总之，结核分枝杆菌实验室检测产品和技术应用进展在提高诊断效率和准确 性、降低检测下限和提升阳性结果的准确率等方面取得了显著成果。未来，随着 传统技术的不断改进和现代技术的不断创新，预计将在结核病的早期诊断、治疗 和预防控制等方面发挥更加重要的作用。
2、生物传感器技术生物传感器是一种将生物分子识别元件与转换元件结合， 用于检测目标分子的分析装置。在结核分枝杆菌检测方面，生物传感器技术显示 出巨大潜力。一种新型的生物传感器可通过电化学信号转换，实现对结核分枝杆 菌的高效检测。该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优点，有望实现结 核病的床旁快速诊断。
结核分枝杆菌DNA分子生物学检测临床诊断价值探讨
结核分枝杆菌DNA分子生物学检测临床诊断价值探讨探讨利用结核分枝杆菌的核酸扩增（PCR）技术，检测结核杆菌DNA在临床诊断中的价值。
方法采用病例对照研究方法，各组诊断采用双盲法，对健康对照组血标本，胸膜炎的胸水标本、腹膜炎的腹水标本、脑膜炎的脑脊液标本和有泌尿系症状的尿液标本，咳痰患者的痰标本进行PCR扩增及ABI—7300仪器荧光检测结核分枝杆菌DNA定量。
应用统计学分析阳性率、敏感性、特异性及各组间的统计学意义。
结果共检测427例，其中初治涂阳肺结核100例，初治涂阴肺结核100例，肺外结核100例，肺部其他疾病77例，健康对照50例。
结核杆菌DNA检测初治涂阳肺结核的阳性率86.0%、敏感性86.0%、特异性96.0%；阳性预测值97.7%、阴性预测值77.4%。
初治涂阴肺结核的阳性率42.0%、敏感性42.0%、特异性96.0%；阳性预测值95.5%、阴性预测值45.3%。
肺外结核的阳性率34.0%、敏感性34.0%、特异性96.0%。
阳性预测值94.4%、阴性预测值42.1%。
结论结核分枝杆菌DNA 分子生物学检测技术是对传统诊断活动性结核病实验室诊断方法的补充，具有较高的敏感性和特异性，对结核病的诊断有重要的诊断价值，成为结核病诊断和研究的重要手段。
【关键词】肺结核；结核分枝杆菌；核酸扩增（PCR）；结核杆菌DNA结核病的实验室诊断方法为结核分枝杆菌的痰涂片和改良罗氏培养法，然而，涂片的阳性率低、培养费时且阳性率不高。
近年来，临床上应用聚合酶链反应（PCR）技术，进行结核分枝杆菌分子生物学检测，灵敏性及特异性高，为结核病的诊断提供了重要的诊断价值，现分析如下。
1 资料与方法1.1 研究对象病例组：选择2010-01-01/2010-12-31住院病例487例，其中男性263例，女性224例，年龄15~87岁。
临床症状：咳嗽425例，咳痰368例，胸闷、气短187例，呼吸困难73例，胸痛98例，发热203例，乏力335例，消瘦139例，尿频、尿急、尿痛82例，腰部酸痛13例，头痛20例，腹痛34例，食欲差296例。
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析摘要：目的对分子生物学技术在结核病诊断中的应用实施分析。
方法本次研究中共计选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，371例患者均为痰涂片阴性病例，对其全部开展DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测技术和改良罗氏培养进行诊断。
结果所有参与本次研究的371例初诊为肺结核疑似病例或临床病例，通过DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测技术进行诊断之后，最终有63例患者确诊为分子生物学阳性病例、47例为培养阳性病例。
DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测阳性率比涂片镜检和改良罗氏培养更高。
结论在对肺结核疑似病例或临床病例实施诊断期间，对患者采取实时DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测具有比较高的诊断效果，值得推广。
关键词:分子生物学技术；结核病；诊断；价值结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,是全球最具威胁的传染病之一。
据世界卫生组织统计,我国患结核病人数居世界第2位,是全世界22个结核病流行严重的国家之一[1]。
结核病实验室检查是结核病诊断、治疗方案制定和治疗效果评估的重要依据。
目前我国大多数实验室广泛采用细菌学检查方法,包括抗酸杆菌痰涂片镜检和分枝杆菌分离培养。
涂片检查简便、易行,但阳性检查率较低[2];分离培养法是目前结核病诊断的金标准,具有很高的灵敏度,但至少需要3~8周的时间,但耗时较长,不能满足结核病早期诊断的要求。
随着分子生物学的发展,近年来涌现出很多方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定[3]。
本文正是基于此，选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，对分子生物学技术在结核病诊断中的应用进行分析，具体的研究情况报道如下。
1资料与方法1.1一般资料本次研究中共计选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，对所有患者共计742份痰标本进行诊断。
结核分枝杆菌分子生物学研究的现状及展望
实用医学杂志2010年第26卷第23期doi：10．3969／j．issn．1006-5725.2010.23.003作者单位：100091北京市，解放军第309医院全军结核病研究所·专题笔谈·结核病是发展中国家较为严重的传染病之一，我国结核病疫情和耐药情况相当严重。
自柯赫发现结核分枝杆菌以来，科学界一直将有效疫苗、药物和诊断技术作为其研究的重要目标，目前又面临耐多药结核病（MDR－TB）、结核病与HIV双重感染等新难题。
分子生物学的诞生与迅猛发展，使我们从分子水平上研究和认识结核分枝杆菌（M．tb）的遗传本质，通过揭示核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用，拓展了结核病的研究领域。
随着M．tb基因组的破译，先进的分子生物学方法的建立，耐药分子机制的阐明，新药物分子靶位的探索，M．tb 特异性分子标记物的确定，致病机制和保护性机制的认识，新疫苗的构建，将为结核病的防治提供有力的新武器。
1M．tb分子生物学研究的现状［1］1．1基因组学的研究［2－3］M．tb H37Rv、CDC1551菌株全基因组测序的完成成为M．tb研究的又一里程碑，标志着M．tb 的研究进入一个崭新的后基因组研究阶段。
H37Rv全基因组序列约4411529bp，4000个基因，G＋C含量较高（平均65．6％），其基因序列高度保守。
3924个可读框（ORF）中参与脂类代谢、细胞壁合成187个，细胞壁代谢360个，脂类合成66个，能量代谢287个，氨基酸合成95个，毒力38个，DNA合成69个，约10％编码两大类不相关的富含甘氨酸的酸性蛋白。
所编码的蛋白约40％有功能，44％可能有功能，而16％是首次发现的。
通过蛋白质组学的研究又发现了一些基因组中不存在的新基因，进一步补充和验证了基因组学的研究。
M．tb不同菌株之间存在多个差异基因，牛结核分枝杆菌缺失11个区段；而卡介苗（BCG）共缺失了16个区段（命名为RD1-RD16），比较基因组学的研究发现了一些M．tb毒力相关基因。
结核分枝杆菌快速检测方法的研究
同济医科大学硕士学位论文结核分枝杆菌快速检测方法的研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：劳动卫生与环境卫生学指导教师：周宜开;徐顺清2000.5.1同济医科大学里主竺竺丝苎摘要自二十世纪八十年代中期以来，随着ＨＩＶ蔓延、耐药菌株产生，世界人口流动增强，结核病发病率、死亡率呈上升趋势，形势严峻，迫切需要建立一种快速、灵敏、准确、经济的结核分枝杆菌（ＭＴＢ）检测方法。
本实验包括三部分，即ＭＴＴ方法的建立，分离培养—ＭＴＴ法检测抗酸分枝杆菌（ＡＦＢ）与分离培养一增强化学发光法（ＥＣＬ）检测ＭＴＢ的研究。
本文首次采用ＭＴＴ法检测ＡＦＢ，探讨了最佳反应条件：ＢＣＧ与ＭＴＴ孵育温度为３７０ｃ，孵育时间为４ｈ，裂解ＭＴｒ三苯基甲脂晶体时间为４ｈ。
ＭＴＴ方法的灵敏度为１０７／ｍｌ。
本文随后部分研究ＡＦＢ快速分离培养法。
实验中以Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９液体培养基为基础，加入选择性抗生素多粘菌素Ｂ、两性霉素Ｂ、头孢菌素Ｃ，终浓度分别为２００Ｕ／ｍｌ、１０Ｉ．ｔｇ／ｍｌ、５Ｉ．ｔｇ／ｍｌ。
ｌ临床痰标本经０．５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ处理后接种于培养基中，每７天用ＭＴＴ方法检测一次，直至出现阳性结果。
佣建立的新方法与罗氏培养基检测了５０例临床痰标本，其中涂片阳性和涂片阴性标本分别为７例、４３例。
最后共分离培养出４１例ＡＦＢ，Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９液体培养基分离培养出了３７例，灵敏度为９０．２４％，罗氏培养基分离培养出了３０例，灵敏度为７３．１７％，Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９液体培养基灵敏度高于罗氏培养基（Ｐ＜Ｏ．０５）。
对于７例涂片阳性标本，Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９液体培养基与罗氏培养基均将其检出。
４３例涂片阴性标本，两种方法共分离培养出了３４例ＡＦＢ，Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９液体培养基分离培养出了３０例（８８．２４％），罗氏培养基分离培养出了２３例（６７．６５％），两者有显著性差异（Ｐ＜０．０５），Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９液体培养基检测涂片阴性标本的能力优于罗氏培养基。
结核分枝杆菌的分子生物学检测研究进展
第17卷 第3期医学研究生学报Vol.17 No.3 2004年3月Journal of Medical Postgraduates Mar.2004·综 述·结核分枝杆菌的分子生物学检测研究进展李子玲1综述, 刘忠令2审校(1.第二军医大学南京临床医学院南京军区南京总医院呼吸内科,江苏南京210002;2.第二军医大学长海医院呼吸内科,上海200433)摘要: 该文对用于结核分枝杆菌菌种及菌株鉴定的基因标记和序列作一综述。
这些基因标记和序列包括插入序列、串联重复序列、存在于质粒p TBN12中的多态性GC丰富的重复序列、36bp顺向重复序列、间隔子寡核苷酸等。
关键词: 结核分枝杆菌; 分枝杆菌; 检测中图分类号: R378.911 文献标识码: A 文章编号: 100828199(2004)0320267203ΞThe advance about study of molecular biology detection of Mycobacteria tuberculosisL I Z i2ling review ing,L IU Zhong2ling checking(1.Depart ment of gerontology,N anjing Clinical School of the Second Military Medical U niversity/N anjing General Hospital of N anjing Com m and,N anjing210002,Jiangsu,China;2.Depart ment of Pul monology,Changhai Hospi2 tal,the Second Military Medical U niversity,S hanghai200433,China)Abstract: This article reviewed the gene markers and the sequences for the detection of the s pecies and strains of My2 cobacteria tuberculosis.The gene markers and the sequences conclude insertion sequences,tandem repeat sequences,the polymorphic GC2rich repetitive sequences contained in the plasmid p TBN12,36bp direct repetitive sequences,spacer oligonucleotides.K ey w ords: Mycobacteria tuberculosis; Mycobacteria; Detection0 引 言 随着结核病的全球性复燃,结核分枝杆菌(M·tubercu2 losis)的菌株鉴定已成为结核病流行病学研究的重要方法。
结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析
结核分枝杆菌诊断技术的发展及目前临床应用的新型诊断技术产品分析快速准确地诊断出结核分枝杆菌感染是控制和治疗结核病的前提和关键。
多年来，结核杆菌的诊断技术在不断地发展和创新，近年来，一些针对结核杆菌检测的新方法陆续被报道，一些新型的诊断技术产品也陆续上市。
本资料综述了结核杆菌的主要诊断方法，并对目前国际市场上广泛应用的商业化诊断技术产品进行了简要分析。
标签：结核分枝杆菌；诊断技术；分析Advance in diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis and analysis of new diagnostic technologies and products in clinical applicationFENG?Meimei1??SU?Wenqin21.Haikou VTI Biological Institute,Haikou 570311,China;2.Department of Pharmacy,Hainan Medical College,Haikou 571199,China[Abstract] Fast and accurate diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection is the key and prerequisite to control and treatment tuberculosis.For many years,the diagnostic techniques of Mycobacterium tuberculosis have been developing and innovating.In recent years,some new techniques for Mycobacterium tuberculosis detection were reported and some new diagnostic products have been listed.This paper reviewed the main diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis,and analysed briefly the commercialized diagnostic products which are used widely in the international market now.[Key words] Mycobacterium tuberculosis;Diagnosis;Analysis结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺结核最多见。
结核分枝杆菌实验室检测方法的研究进展
结核分枝杆菌实验室检测方法的研究进展结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病。
它已成为严重危害人民身体健康、发病率及病死率很高的传染病。
由于细菌学检查阳性率低及血清学诊断的敏感性和特异性不高等原因，因此结核病的诊断一直是临床上的难题。
发现和研究对结核分枝杆菌诊断较敏感和特异性且快速、简便的实验室检测方法，对结核病的预防和诊断具有重要的意义。
笔者就目前国内外结核分枝杆菌的检测方法现状及其进展作一综述。
标签：结核分枝杆菌；结核病；检测方法；研究进展近年来，由于人口的剧增、世界范围内大面积的人口大流动、菌株变异和耐药性的产生、HIV感染流行等种种原因，在世界上许多地方结核病发病率出现了回升的现象。
结核分枝杆菌是结核病的主要致病菌，可在人群中传播，对外界环境的抵抗力强，易产生耐药菌株[1]。
传统检测结核分枝杆菌的方法有涂片找结核分枝杆菌法、培养法以及抗原抗体反应法等，但这些方法特异性、敏感度较差，且操作繁琐、耗时。
近年来，实验室研究出了一系列的新技术和方法，对传统的检测技术加以补充，弥补了其不足，取得了很大的进步，现对其研究进展综述如下：1 细菌学诊断技术1.1 涂片法1.1.1 直接厚涂片法直接厚涂片法检出率比普通涂片法高14%～19%，这种方法快速、费用低，是目前国内常用方法，也是《结核病诊断细菌学检验规范》规定的方法。
1.1.2 集菌涂片法通过加大被检标本的体积或通过离心、浮游等方法，富集标本中的抗酸杆菌，与厚涂片法相比，方法操作繁琐、临床应用不多。
涂片抗酸染色法，虽然有简便、快捷、成本低廉的优点，但其敏感性低，为36.8%，特异性为94.3%，且不能区分结核与非结核分枝杆菌[2]。
1.2 培养法1.2.1 BACTEC-TB-460快速检测系统其主要原理是测定结核分枝杆菌的代谢产物。
在米氏7H12培养基中加入含放射性14C的量，用生长指数GI值表示，大于19为阳性[3]。
该法有较高的初代分离率，显著缩短了报告时间，阳性标本最早仅需2 d就能检出，阴性一般1个月可发报告；而传统的改良罗氏法最早检出一般为20 d左右，阴性2个月发报告。
结核分枝杆菌耐药的分子机制及分子生物学检测方法进展
ＸＩ ｎｚ ａｇ Ｃ Ｅ Ｃ ａ ｇｉ ＥＭｉｇｈ ｎ ， Ｈ Ｎ ｈｎ ｊ ｅ
（ ａ ｇ ｕＭｅ ｉｉｅ ｏｌ ｅ Ａ ｈ ｉ ａ ｇ ｕ２ ３ ３ ， ｈ ａ Ｂ ｎ ｂ ｄｃ ｌ ｇ ， ｎ ｕ， ｎ ｂ ３ ０ ０ Ｃ ｉ ） ｎ Ｃ ｅ Ｂ ｎ
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药 物敏 感 实验 的早 期检 测 可 以实 现对 患者 的早 期 合 理治疗 ， 而提高疗 效 ， 从 缩短治疗 周期 ， 高治愈率 。 提
２ 耐药机 制
也显示 ｒｏ ６ ５１ ｐＢ５ 、３ 两个位点 为利福平耐药 的高频突 ２ 变位点 ， 而且以单 ・突变为主。Ａ ｔ ｎ［等研究不 同药 ｎ ｏｙ ｈ ３
结核病分子生物学检测技术研究进展
基于上述研究 在检测涂片阳性肺结核 显示 和 B-J*++/
'PE1E`;EDC
结核分枝杆菌特异性抗原检测的研究现状及展望
结核分枝杆菌特异性抗原检测的研究现状及展望【关键词】分枝杆菌;结核；抗原；检测结核病的实验室诊断技术主要包括细菌学、免疫学和分子生物学等三大领域的诊断方法。
与细菌学和分子生物学技术相比，免疫学诊断技术同时兼具简便、快速、价廉、无需贵重仪器、容易在基层实验室推广等优势，因此，长期以来一直是结核病研究人员重点关注并且坚持不懈努力的研究方向。
结核病免疫学诊断分为两个类型：①依据机体对病原菌——结核分枝杆菌（MTB）诱发的免疫应答反应进行检测，又分为体液免疫检测和细胞免疫检测两个方面；②针对病原菌MTB 的特异性抗原进行检测。
由于机体受到MTB感染后，体内首先出现的是结核分枝杆菌特异性抗原，并且结核抗原的检测可以作为结核杆菌存在的直接证据，可以避免结核病患者由于免疫应答低下导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的“假阴性”，因此检测结核分枝杆菌特异性抗原更有可能发展成为结核病早期、快速、敏感、特异，并且适宜在发展中国家推广应用的新型诊断方法，因而也越来越受到人们的重视。
现就结核分枝杆菌特异性抗原检测的研究进展做一综述。
1 结核分枝杆菌特异性抗原检测的技术方法1.1 凝集试验（Agglutination test）Krambovitis等［1］于1984年首次报道了胶乳凝集试验（LPT）在结核病诊断的中的应用。
作者通过纯化兔抗结核分枝杆菌胞膜抗原免疫球蛋白致敏乳胶颗粒，检测脑脊液（CSF），观测凝集发生与否诊断结核性脑膜炎。
Cambiaso 等［2］通过将牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）抗体（Fab'）2 连接乳胶颗粒，对组织液标本中的结核抗原进行检测，较大地提高了检测敏感性。
Chandramuki 等［3］应用反向间接血凝试验（RIHG）对结核性脑膜炎CSF中结核抗原检测进行了探索。
1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）Sada等［4］于1983年首次建立了双抗体夹心ELISA（s ELISA）检测CSF中结核抗原，取得了较为理想的的检测结果。
结核分枝杆菌实验室检测方法的临床研究
结核分枝杆菌实验室检测方法的临床研究结核分枝杆菌是导致结核病发生的主要致病菌，传染性强，具有较高的发病率和病死率。
通常临床诊断结核病时，对诊断方法要求高，需准确、快速、特异性诊断，同时可以准确判断结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。
目前结核分支杆菌实验室检测方法日益增多，而其检测结果的敏感性和特异性并没有显著提高。
本文就对结核分枝杆菌实验室检测方法进行综述研究，以此寻求简单方便、准确性高、应用广泛的实验室检测方法。
标签：结核分枝杆菌；实验室检测方法；结核病结核病是目前世界严重性慢性传染病，在早期WHO就以对结核病发出紧急预告。
结核分枝杆菌也可称为结核杆菌，在1882年Koch证明其是结核病病原体[1]。
现今诊断技术、治疗方法的改进与发展，相应降低了结核病的死亡率。
但随着而来的是结核分枝杆菌耐药菌株的出现，使结核分枝杆菌耐药率不断上升，死亡率不减反增[2]。
在治疗和控制结核病时，主要是根据实验室检测方法早期准确对结核分枝杆菌的诊断。
现综述如下文。
1细菌学诊断技术1.1直接厚涂片法直接厚涂片法操作简单、方便快速，成本低廉，是临床诊断结核病细菌学常用方法。
相关资料显示采取直接厚涂片法，其检出率与普通涂片法相比，其高出率高达19%[3]，是《结核病诊断细菌学检验规范》中对结核病诊断的规定方法。
1.2集菌涂片法集菌涂片法利用检测标本体积或离心、浮游等方法，使标本中结核杆菌富集，操作复杂，应用少。
涂片法的应用，成本低廉，操作简单，但敏感性约为37%，较低，特异性为94%[4]，无法有效准确区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。
1.3 BACTEC-TB-460快速检测系统BACTEC-TB-460快速检测系统可对结核分枝杆菌代谢产物进行有效测定，于米氏7H12培养基中添加放射性14C量，阳性则为生长指数GI值超过19[5]。
此种方法初代分离率较高，报告时间短，2d 内可检出阳性标本，而改良罗氏法最快需要约20d才可检测出阳性结果，阴性检测需2个月报告，而BACTEC-TB-460快速检测系统只需1个月[6]。
结核分枝杆菌的实验室检测现状及现代结核病诊断的新特点
结核分枝杆菌的实验室检测现状及现代结核病诊断的新特点【摘要】自1882年德国细菌学家郭霍（Koch）发现结核分枝杆菌（MTB）以来，为促进结核杆菌生长，缩短培养时间，达到提前分离、鉴定的目的，人们对结核杆菌的营养、生理代谢及人工培养进行了一系列的研究，使得结核杆菌的检测技术从最初的涂片镜检、分离培养发展到现在的分子生物学及噬菌体裂解技术水平。
由于分枝杆菌自身结构及遗传性的原因，决定了其营养要求高，生长缓慢的特性，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发展缓慢，不利于早期诊断和治疗，对结核分枝杆菌的快速诊断是应势而需！多种方法的联合应用使结核病诊断呈现出新的特点。
【关键词】结核分枝杆菌；病原学检查；分子生物学；噬菌体【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-2787-011 结核分枝杆菌实验室诊断概况1.1病原学诊断1.1.1 染色镜检法1.1.1.1 涂片抗酸染色镜检法该法简便、快速、价廉；但敏感性低，特异性差：所有分枝杆菌均可着色，无法区别死菌与活菌，结果均为阳性。
1.1.1.2荧光染色法在涂片法中阳性率较高，荧光显微镜下的抗酸杆菌阳性率可达50%；但假阳性率较高，保存时间短，不到4个月。
1.1.1.3液基夹层杯结核杆菌检验该法操作方便，片中结核菌分布均匀，染色效果清晰；液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提高；消化，制片，烤片，采用结核专用消化液，可有效杀灭结核分枝杆菌，染色均在彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本，更好的提高了操作的安全性。
1.1.1.4液体培养+显微镜观察药敏试验是2000年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技术。
能在培养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，能显著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，同时具有较高的敏感性和特异性，痰标本直接药敏试验比常规方法提早6～8周，更具有快速诊断价值.1.1.2培养法1.1.2.1传统培养法如改良罗氏培养法，该法准确，灵敏度略高于涂片法；可以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验；但诊断周期长，最快也需要6周，有一定的污染率。
结核杆菌的最新研究进展
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结核杆菌诊断技术研究进展
三、分子生物学诊断方法 1 、结核杆茵 结核杆茵DNA扩增法 扩增法(PCR法) 扩增法 法 在过去的20年 已建立起多种PCR技术用来检测结核 在过去的 年，已建立起多种 技术用来检测结核 分枝杆菌特异性的靶序列。实验证明， 是一种简便、 分枝杆菌特异性的靶序列。实验证明，PCR是一种简便、 是一种简便 快速、灵敏、特异的基因诊断技术， 快速、灵敏、特异的基因诊断技术，特别适用于因排菌量 结核杆菌发生L型变异而被常规细菌学检查漏诊者的 少、结核杆菌发生 型变异而被常规细菌学检查漏诊者的 早期诊断、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察， 早期诊断、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察，标本不需 要预培养，有很高的临床诊断价值。虽然PCR技术有诸 要预培养，有很高的临床诊断价值。虽然 技术有诸 多好处，但是目前该方法仍缺少权威性的诊断试剂盒， 多好处，但是目前该方法仍缺少权威性的诊断试剂盒，存 在的主要问题是扩增时气溶胶污染导毁的假阳性、 在的主要问题是扩增时气溶胶污染导毁的假阳性、标本中 PCR抑制物质导致的假阴性，因此还有待进一步改进。 抑制物质导致的假阴性， 抑制物质导致的假阴性 因此还有待进一步改进。
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结核杆菌的最新研究进展
研究生13班 研究生 班 刘红娜 吉尚雷
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结核杆菌的介绍
结核杆菌诊断技术研究进展
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结核疫苗研究进展 结核疫苗研究未来展望
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结核杆菌的介绍
自从1882年Robert Koch发现结核分枝杆菌 年 自从 发现结核分枝杆菌 (MTB)以来，已报道的分枝杆菌有 以来， 多种。 以来 已报道的分枝杆菌有100多种。有关 多种 分枝杆菌的分类方法很多， 分枝杆菌的分类方法很多，通常分为典型结核分枝 杆菌(TM)和非结核分枝杆菌 和非结核分枝杆菌(NTM)。 杆菌 和非结核分枝杆菌 。 TM包括人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非 包括人型结核分枝杆菌、 包括人型结核分枝杆菌 牛型结核分枝杆菌、 洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌， 洲结核分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，又称为结核分枝 杆菌复合群(MTBC).该群中 该群中DNA相关性为 ％一 相关性为85％ 杆菌复合群 该群中 相关性为 100％，分类地位相近。 ％，分类地位相近。 ％，分类地位相近 NTM包括 包括MTBC和麻风分枝杆菌以外的所有其他分 包括 和麻风分枝杆菌以外的所有其他分 枝杆菌，在自然界中分布广泛，由于NTM对氯化物 枝杆菌，在自然界中分布广泛，由于 对氯化物 具有抗性，它们甚至可以在自来水管道系统中生存。 具有抗性，它们甚至可以在自来水管道系统中生存。
结核分枝杆菌的分子生物学鉴定
结核分枝杆菌的分子生物学鉴定结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起人类结核病的主要病原体，具有很高的传染性和致死率。
目前，结核病仍然是全球公共卫生问题，尽管已经有了许多有效的治疗方案，但是由于结核分枝杆菌的进化和抗药性的出现，人类与结核病之间的斗争仍然在进行。
结核分枝杆菌的种类很多，据估计约有150种，但其中只有少数能够感染人类。
因此，在进行结核病诊断和治疗时，需要对病原体进行准确鉴定。
传统鉴定方法主要基于形态学、生理化学和生物学特征等方面，但是这些方法往往需要很长时间，且存在误判的风险。
近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，结核分枝杆菌的分子生物学鉴定技术逐渐成为一种快速、准确、可靠的鉴定方法。
分子生物学鉴定技术主要包括PCR、脱氧核糖核酸（DNA）序列分析和病原菌基因芯片技术等。
其中，PCR技术是最常用的方法之一。
PCR技术利用特异引物扩增病原体基因（一般选择16S rRNA和IS6110基因），然后通过凝胶电泳分离和检测，可实现对结核分枝杆菌的快速鉴定。
另外，PCR技术也可用于检测结核分枝杆菌的耐药性基因以及特定毒力因子等。
DNA序列分析是一种更加准确的结核分枝杆菌鉴定方法。
它利用PCR技术扩增目标基因，然后将扩增产物纯化、测序，并与基因序列数据库比对，确定结核分枝杆菌的种类和亚型等。
由于M. tuberculosis的基因组序列已经被测定，DNA序列分析对于对结核分枝杆菌的鉴定更为准确和可靠。
病原菌基因芯片技术是一种较新的结核分枝杆菌鉴定方法，它利用在晶片上固定的检测探针，可同时检测数以千计的病原菌基因（包括结核分枝杆菌和其他病原体），并通过计算机软件分析得出结果。
这种技术不仅可用于结核病诊断，还可以用于监测传染病病原体在不同地区的分布、病原体进化、抗药性的形成等方面的研究。
总之，分子生物学鉴定技术为结核病的诊断和治疗提供了更加快速、准确、可靠的解决方案。
结核病的分子生物学诊断技术研究进展
２ １２ 在 Ｐ Ｒ基 础上发展 的核酸 扩增 技术 ．． Ｃ
① Ｐ Ｒ 单链 Ｃ－
构象多态性分析 （ Ｃ ．Ｓ Ｐ 。是检测单碱 基突变 可靠而 简 Ｐ ＲＳ Ｃ ） 便的方法 。Ｐ Ｒ产 物为两条 互补单链 ， Ｃ 各单链 的碱基序列 不 同可形成不 同的空 间构 象 ， 凝胶 上显示 不 同 的带型 ， 确 在 可 定有 无突变 。 目前 采用 Ｐ Ｒ Ｓ Ｃ Ｃ —Ｓ Ｐ技术 分析 耐 多药结 核 杆 菌的耐药机理 已成为研究热点 ， 尤其是该法 直接 检测临床 标 本中结核杆菌耐药基 因的成功 ， 会对传统结核 药敏试验 产 将 生新的挑 战。Ｓ ｅｎ等 学者 检测 比嗪酰胺 的耐药基 因 ， ｈｅ 与
２ 结核病 的分 子生物学诊断技术 ２ １ 核酸扩增技术 ．
径。
基因突变 ， 分别 检 出突变基 因 １ 株 、９株 、４株 ， 该法 不 ６ １ ｌ 但
能确定突变部位和性质 ， 对操 作技 术要求 过 高 ， 响因素 较 影
多 ， 前 只在 条件 较好 的实 验 室 开展研 究 。② 序列 特 异 引 目
断， 缺点是无法 区别 死菌和活菌 。巢式 Ｐ Ｒ 半 巢式 Ｐ Ｒ采 Ｃ 、 Ｃ
近１ ０余年 来 ， 核病 发病呈 全球 持续 恶化 ，０７年 死 结 ２０ 于结 核病 的患者约 １７万 ｊ ７ 。结 核杆菌 是结 核病 的主要致 病菌 ， 可在人群 中传播 ， 对外界环境 的抵抗力强 ， 易产生耐 药
山东医药 ２ １ 年第 ５ Biblioteka 第 ３ 期 ０１ １ ｌ・
综述 与讲 座 ・
结 核 病 的分 子 生 物 学诊 断技 术 研 究 进 展
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BH2结构,自身形成同源二聚体(Bcl-2/Bcl-2或Bax/Bax)或相互形成异源二聚体(Bcl-2/Bax)。
Bax/Bcl-2的比值,对于决定细胞接受刺激信号后存活与否有关键性的作用。
一般而言,Bcl-2过度表达与Bax形成异二聚体而阻抑凋亡,使细胞存活;Bax过量表达则形成Bax/Bax同源二聚体,使细胞发生凋亡。
对Bcl-2、Bax基因在肿瘤细胞凋亡中所起作用的研究较多,但对其在肾小球硬化中所起作用的研究较少。
经本实验中的免疫组化发现,Ox-LDL(25～100μg/ml)分别作用于人肾小球系膜细胞后,系膜细胞Bax和Bcl-2蛋白表达都升高,24h后Bax蛋白水平逐渐增加,而Bcl-2蛋白水平逐渐减低,在作用48h、72h后这种效应更明显,给予抗氧化V E[5]预处理后,与对照组相比,Bax和Bcl-2的变化不显著,这一现象提示:Bax蛋白表达增加导致Bax/Bcl-2比值上升可能是Ox-LDL诱导肾小球系膜细胞凋亡的机制之一。
但是,Bax与Bcl-2蛋白量的比值究竟达到多少时能调控细胞趋向于增殖或凋亡,Bax和Bcl-2蛋白究竟通过什么途径调控细胞趋于增殖或凋亡,这些问题尚需进一步研究。
4 参考文献 [1] Mattana J,K ocklaty S,G ibbons N.Metal-catalyzed oxidationof extracellular matrix proteins promotes human messangeial cellapoptosis and is associated with enhanced expression of Bax andcaspase activation.Biochem Biophys Res Commun,2002,292(3):6522658 [2] Wanner C,Quaschniing T.Dyslipidemia and renal disease:pa2thogenesis and clinical consequences.Curr Opin Nephrol Hyper2tens,2001,10(2):1952201 [3] Lee HS,K im YS.Identification of oxidized low densit y lipop2rptein in human renal biopsies.K idney Int,1998,54(3):8482856 [4] Lee HS.Oxidized LDL,glomerular mwsangial cells and collgen.Diabetes Res Clin Pract,1999,45:1172122 [5] Saborio P,Krieg RJ,Kuemmerle NB,et al.Alpha-tocopherolmodulates lipoprotein cytotoxicity in obstructive nephropathy.Pediatr Nephrol,2000,14:7402746[2002—09—19收稿 2002—12—27修回]文章编号 1007-9564(2003)02-0174-02结核分枝杆菌的分子生物学检测方法研究现状116017 辽宁省大连市,解放军大连医学高等专科学校病原学教研室 陈晓旭关键词 结核分枝杆菌;分子生物学检测中图分类号 R-33 文献标识码 A 结核分枝杆菌感染所致的结核病是当今世界上最普遍的人类传染病之一,其发病率、病死率在全球范围内呈上升趋势,是严重危害人类健康的公共卫生问题。
近年来,我国结核病的流行十分严重,疫情下降缓慢,有些地区有回升的趋势,这些情况已引起我国学者的高度重视。
因此,我国已将结核病作为重点防治的传染病之一。
然而,结核病的早期发现主要依赖于实验室诊断技术。
随着分子生物学技术的发展,结核病分子流行病学研究、耐药性研究的新技术也逐步建立起来。
分子生物学技术在结核病研究领域里的应用,使人们能够对结核分枝杆菌进行更敏感、特异、快速、准确的检测和鉴定。
本文就结核分枝杆菌的分子生物学检测方法的研究现状作一概述。
1 核酸探针检测法核酸探针是指用放射性或非放射性物质标记已知的DNA或RNA片段。
核酸探针检测法的基本原理是用已知的核酸探针检测样品中未知核苷酸顺序,如有顺序完全互补的核苷酸顺序,则通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合,再经显影或显色的方法,将结合核苷酸顺序的位置或大小显示出来。
核酸探针技术的显著优点是特异性强,已在医学科研和疾病诊断的许多方面显示出重要的应用价值和应用前景。
该技术在结核分枝杆菌的检测、菌种鉴定及耐药性等方面得到了广泛应用,且国内外的学者都积极致力于进一步提高核酸探针敏感性和特异性的研究,并有了实质性的进展。
庞茂银等[1]报道,应用线形探针分析快速检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变,其敏感性可达94.4%,与药敏结果的复合率为96.4%。
还有的研究者采用一种全新的裂解液与DNA 探针、化学发光自显影优化组合成一个整体,直接检测临床标本中的结核分枝杆菌。
研究结果表明,本法已成功地用于痰、脑脊液和胸腔积液等结核体液标本的检测,据此认为,该检测技术具有高敏感性和特异性,且操作简便、经济,适用于常规检测[2]。
2 聚合酶链反应(PCR)1985年美国的Mullis等人发明了PCR,为研究和分析基因提供一种全新的分子生物学方法。
聚合酶链反应是一种体外酶促反应,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,经过n个周期后,理论上可以获得的2n双链DNA分子,使DNA特定区段大量扩增。
此检测技术敏感性高,特异性强,受到人们普遍的关注,已用于多种疾病的诊断。
1989年首次将PCR技术运用到结核分枝杆菌的检测,且在结核病的研究领域中得到广泛应用。
然而,该技术在临床应用过程中也暴露出一些问题,如假阴性、假阳性、污染、质控等方面情况,除了各种人为的因素外,PCR技术自身检测方法仍存在一定的问题。
因此,多年来,研究者一直在进行着坚持不懈的努力,积累了大量资料和经验,以使该技术不断的改进、完善和发展。
随之,新的PCR及其衍生技术不断地建立起来,如巢式PCR法、逆转录PCR法等[3,4]。
有资料表明[5,6],PCR法与核酸探针联合应用检测结核分枝杆菌与单纯的PCR扩增相比,从敏感性和特异性方面比较,前者均显示出明显的优势。
聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法在结核菌菌种鉴定和耐药基因测定等方面研究・471・Chinese Journal of Coal Industry Medicine February2003,Vol.6,No.2中也表现出较高的应用价值[7,8]。
3 DNA指纹技术以结核分枝杆菌染色体DNA限制性酶切片段长度多态性(RFL P)特征为基础建立的DNA指纹技术,可根据结核分枝杆菌菌株DNA指纹图谱,在株水平上对结核分枝杆菌进行鉴定,进而成为研究结核病流行病学的重要手段之一。
目前,在国内应用比较广泛的是以插入序列IS6110为基础的结核分枝杆菌菌株鉴定技术,此方法具有特异、灵敏等优点[9]。
但以IS6110为基础的DNA指纹技术在应用中仍然存有一些问题,如实验时需要较复杂的设备及技术条件,影响实验的因素多等。
近来,研究者又在PCR的基础上建立起一种新的基因分型法即随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹技术[10],此方法是利用随机引物与细菌基因组多个部位结合,在DNA扩增仪中产生不同分子量的DNA片段后,通过凝胶电泳获得指纹图谱进行分析。
我国学者钟敏等[11]应用随机扩增多态性DNA聚丙酰胺凝胶电泳(PAPD-PA GE)指纹技术对结核分枝杆菌进行了研究,结果证实,该方法具有特异、敏感、重复性好、简便、经济等特点,适宜推广应用。
4 基因芯片基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)始创于20世纪90年代初,是当今分子生物学最前沿的高新技术[12]。
其基本原理是将大量探针分子固定在支持物(玻璃、硅片等)上,然后与待检标本中标记的DNA或RNA进行分子杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
由于此技术是将大量探针同时固定在玻璃等支持物上,所以,可以一次性对样品大量序列进行检测和分析,从而,解决了传统核酸印迹技术的操作繁杂,自动化程度低,操作序列数量少,检测效率低等缺点。
如今,基因芯片以其可同时、快速、准确分析成千上万个基因组信息等优点在生命科学的众多领域显示出巨大的发展潜能。
此技术在结核分枝杆菌的研究中也发挥着重要的作用,可用于菌种的鉴定、耐药性的监测、基因组比较分析等方面的研究。
1999年,国外学者Troesch等[13]采用在位合成法研发了首块结核病相关的芯片。
目前,国外基因芯片技术发展很快。
虽然,在我国曾有应用DNA芯片检测结核菌耐药性的研究报道[14],但是,我国尚未有较成型的基因芯片问世,如何使基因芯片技术产业化,并不断完善和发展此技术是我国学者所面临的重大研究课题。
总之,建立特异性强、敏感性高、简便、快速、先进科学、经济实用的结核分枝杆菌检测技术,对结核病做到早期诊断、早期防治是研究工作者的奋斗目标。
我们相信,随着国内外学者不断的艰苦努力及科学技术的不断进步,尤其是分子生物学在医学领域的迅猛发展,将为未来人类能够彻底防治结核病这一古老的传染性疾病带来光辉的前景。
5 参考文献 [1] 庞茂银,翁心华,张文宏,等.应用线性探针分析快速检测耐利福平结核分枝杆菌的rpoB基因突变.中华传染病杂志,2001,19(6):331 [2] 杨树德,杨华卫,高振翔.应用DNA探针杂交化学发光自显影检测结核分枝杆菌.中华检验医学杂志,2002,25(2):109 [3] Soolingen DV,Dehass PE,Hemans PW,et parison of var2ious repetitive DNA elements as genetic marks for strain differ2entiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis.J ClinMicrobiol,1993,31:1987 [4] 蔡雄茂,周伯平,陈心春,等.结核病人外周血结核分枝杆菌聚合酶链反应检测及临床意义.中华结核和呼吸杂志,2000,11(23):695 [5] 王卫华,肖红,肖勇,等.长臂光敏基因探针对结核性浆膜腔积液的诊断价值.中华检验医学杂志,2001,24(2):79 [6] 李国利,赵铭,庄玉辉,等.聚合酶链反应分子灯塔法检测结核分枝杆菌.中华检验医学杂志,2001,24(2):82 [7] 李洪敏,吴雪琼,才晓军,等.建立快速检验结核分枝杆菌复合群的方法.中华检验医学杂志,2001,24(3):172 [8] 钟敏,温博海,陈荣,等.检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究.中华检验医学杂志,2002,25(1):38 [9] 王苏民,李卫民,刘枫春,等.结核分枝杆菌DNA指纹技术及其应用.中华医学检验杂志,2001,24(2):76[10] Olmos A,Camarena JJ,Nogueira J M,et al.Application of anopti2mized and highly discriminatory method based on arbitrarilyprimed PCR for epidemiologic analysis of methicillin-resistantStaphlococcus aureus nosocomial infections.J Clin Microbiol,1998,36:1128[11] 钟敏,温博海,陈炜,等.结核分枝杆菌随机扩增多态性DNA指纹分型技术及应用研究.中华检验医学杂志,2002,25(2):91[12] Cheung V G,Morley M,Aguilar F,et al.Making and reading mi2croarrays.Nature G enetics,1992,21:15[13] Troesch A,Nguyen H,Miyadac G,et al.Mycobacterium speciesidendification and rifampin resistance with high density DNAprobe arrays.J Clin Microbil,1999,37:4955[14] 景奉香,胡忠义,孙悦,等.用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性.中华结核和呼吸杂志,2001,24(9):551[2002—06—26收稿 2003—01—06修回]欢 迎 投 稿 欢 迎 订 阅本刊网址:WWW1OK1201COM・571・中国煤炭工业医学杂志2003年2月第6卷第2期。