结核分枝杆菌实验室检测方法
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• 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌 脓肿亚种属于迅速生长型，鸡蛋培养基上3-5天可 见菌落
麻风分枝杆菌
• 麻风分枝杆菌（M.leprae）是麻风病的病原 体，也是抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短 而粗，两端尖细，抗酸染色着色均匀，呈 束状或团状排列，结核分枝杆菌多散在， 偶有聚集。为典型的胞内寄生菌，有麻风 杆菌存在的细胞胞浆呈泡沫状，称麻风细 胞。
联染法：敏感性高，特异性好，速度快！
抗酸染色局限性
• 抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如 Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（红球 菌属）、Legionella micdadei（军团菌）、 cryptosporidium（隐孢子虫）、Isospora （等孢球虫）等有抗酸菌特点
• 不能区分结核和非结核分枝杆菌 • 不能区分活菌和死菌 • 敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条
感性和特异性，可结合传统方法综合分析
Thank You!
www.themegallery.com
22
分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）
检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、 土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。
➢ 高 效： 同时检测 17 种分枝杆菌（包括TB） ➢ 快 速：＞4周（菌种鉴定） 6 小时 ➢ 灵 敏： 103 个菌/反应
23
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒
田斌等，发光二极管荧光显微镜在基层实验室诊断结核分枝杆菌的应用评价. 实用预防医学2012年10月第19卷第10期.
分枝杆菌培养技术
• 结核菌培养仍是目前诊断的金标准．尤其是药敏 试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具 有重要作用, 是鉴定是否为活菌的可靠方法．
• 1、传统的固态培养法 需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳
病原学 免疫学 分子生物学
• 萋尼染色+荧光染色 • 罗氏培养+分枝杆菌快速培养
• 抗原抗体检测 • 细胞因子检测
• 荧光定量PCR • 芯片杂交
涂片镜检--抗酸染色
• 抗酸染色是目前为止最快的结核检出方法， 可用来检测病情进展，为感染控制提供参 考依据，可确证培养物为阳性
• 萋尼染色法—红色—普通显微镜（高倍） • 荧光染色—黄或橘色—荧光显微镜（低倍）
• 体外不能培养。
结核分枝杆菌
• 全球约有1/3的人口已经感染结核分枝杆菌，有 2000万活动性肺结核患者，每年新发病例900万 人，每秒钟有1人感染结核，每年有300万人死 于结核病。
• 随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的 改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降
• 20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌 耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、 贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的 疫情骤然恶化
6
生物学形状
结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，有时可见 分枝状，无芽孢和鞭毛，因衰老或抗结核药物的 作用可出现多形态，如球状、串珠状或丝状， 大小为1～4X0.4μm。
细胞壁中含有大量脂质而不易着色，特别是有 大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，一般 用抗酸染色。萋尼染色呈红色，背景为蓝色； 荧光染料金胺“O”染色，荧光显微镜下为橘黄色
结核分枝杆菌实 验室检测方法
分枝杆菌属
• 一类细长略带弯曲，有时呈分枝状的杆菌，本属 细菌多具有抗酸性，又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus），细菌体内含有分枝菌酸，细胞壁含有 大量脂类，这与分枝杆菌的染色性、抵抗力和致 病性等密切相关。
• 本属细菌已经被鉴定的有70多种，可分为三大类： 结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌；
基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对
耐多药结核病做出快速诊断。
➢ 通 量：两个一线抗结核药（MDR） ➢ 速 度：8周（药敏） 6 小时 ➢ 灵敏度：103 个菌/反应
24
五种结核检测方法效果评价
涂片法
MGIT 960 快速培养
斑点层析法
结核组：1260例
非结核组：100例
菌时可检出，而培养可检出>10-100条菌.
发光二极管荧光显微镜（LED）
• 荧光显微镜成本高、易损坏、耗电量大、 光源寿命短、显微镜价格昂贵且需要在暗 室内工作等，荧光染色法一直没有在结核 病痰涂片诊断中得到广泛的应用。
• 只需将二极管替换普通光学显微镜的目镜 就相当于一台荧光显微镜，组装的“荧光 显微镜”结合金胺O染色在结核病痰涂片检 查中有一定的应用价值。
• 对活动性结核的诊断灵敏度高达77％，
Biblioteka Baidu
局限性：
• 假阴性： • 小儿结核、老年人结核、免疫缺陷或免疫
功能低下患者（如合并HIV感染、接受免疫 抑制剂治疗的患者) • 假阳性： • 接种过卡介苗的人也会产生阳性反应
γ干扰素释放试验
被认为是近十年来结核诊断史上取得的最重 要成就，该检测方法的原理是：结核感染后 体内长期存在抗原特异性的记忆性Ｔ 细胞， 当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增值， 释放γ干扰素。 •目前市售两种， QFT-G和T-SPOT.TB，比 较两种方法， T-SPOT.TB更灵敏但QFT-G更 特异，但均优于结核菌素试验，同时也被推 荐用于潜伏结核诊断。
• 结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌
非典型分枝杆菌
• 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟/脓肿、胞内分枝杆 菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆 菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆 菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、 海-溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆 菌、蟾蜍分枝杆菌等
固体培养和液体培养优缺点
• 固体培养：污染少，易于进行菌落形态观 察，但是培养时间长
• 液体培养：菌体与培养基充分接触，生长 迅速，但易受到污染
血清学试验
免疫学检测方法
• 1、结核菌素试验 • 凡感染过结核杆菌的机体，会产生相应的
致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能 力，当再次遇到通过皮肤注入的少量的结 核菌素时，致敏Ｔ 淋巴细胞受相同抗原再 次刺激会在48-72小时内，产生局部炎症反 应，出现红肿硬节即为阳性反应。
培养特性
培养基
• 营养要求高，必须在含血清，卵黄，马铃薯，
甘油及无机盐类的特殊培养基上生长，常用的 有罗氏固体培养基
• 专性需氧，3%-5%CO2能促进其生长最适温 培养条 度为35-37℃，最适pH为6.5-6.8
件
• 菌落粗糙型，表面干燥成颗粒状，不透明，乳
菌落特 点
白色或淡黄色，菜花样
8
实验室检测方法
分子生物学检测方法
• 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发 展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验 提供了极大的方便，可将诊断时间从几周 降低到几天。研究、应用报道较多的结核 病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应 (PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基 因芯片、基因分型等。
分枝杆菌分子诊断系统（协和医院）
改良罗 氏培养
荧光 PCR
结果比较
高会霞等，五种结核病实验室检测方法对结核病诊断价值的 效果评价.实用检验医师杂志，2012，4（3）：157-160.
敏感性、特异性比较
罗氏培养和快速培养
快速培养和荧光PCR
总结：
• 涂片简单快速但阳性率较低、难以区分结 核和非结核分枝杆菌
• 培养为金标准，但需时较长 • 血清学试验检测结核抗原或抗体不太理想 • γ干扰素释放试验能较好地为临床服务 • 荧光PCR检测结核分枝杆菌具有较好的敏
性率也只有30％-40％；特异性差．各种分枝杆菌均 可生长。要确定是否为结核菌．需结合分枝杆菌菌 种鉴定和药物敏感性试验。
2、分枝杆菌快速液体培养技术
• BD公司推出的BACTEC—MGIT 960全自动 分枝杆菌培养，鉴定／药敏系统，操作简 便，阳性标本检出时间平均为9d：鉴定、 药敏试验时间平均为4d：阳性标本检出率 比传统固体培养提高10％左右
实时荧光PCR
基因芯片快速检测平台
分枝杆菌核酸检测
分枝杆菌菌种鉴定
结核分枝杆菌耐药基 因检测
筛查、鉴别诊断
菌种鉴定
MDR早期诊断
分枝杆菌核酸检测
功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断
➢ 高 效： 一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM ➢ 快 速： 4周（菌培） 3 小时 ➢ 灵 敏： 10 个菌/反应（TB）；102 个菌/反应（NTM）
• 按生长速度可分为三类，即缓慢生长菌、迅速生 长菌和不能培养菌三种类型
结核分枝杆菌群
• 结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包 括人结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、非洲 分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌 （M.microti），前三种对人类治病，其中人型结 核分枝杆菌感染发病率最高。
麻风分枝杆菌
• 麻风分枝杆菌（M.leprae）是麻风病的病原 体，也是抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短 而粗，两端尖细，抗酸染色着色均匀，呈 束状或团状排列，结核分枝杆菌多散在， 偶有聚集。为典型的胞内寄生菌，有麻风 杆菌存在的细胞胞浆呈泡沫状，称麻风细 胞。
联染法：敏感性高，特异性好，速度快！
抗酸染色局限性
• 抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如 Nocardia（奴卡）、Rhodococcus（红球 菌属）、Legionella micdadei（军团菌）、 cryptosporidium（隐孢子虫）、Isospora （等孢球虫）等有抗酸菌特点
• 不能区分结核和非结核分枝杆菌 • 不能区分活菌和死菌 • 敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条
感性和特异性，可结合传统方法综合分析
Thank You!
www.themegallery.com
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分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）
检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、 土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。
➢ 高 效： 同时检测 17 种分枝杆菌（包括TB） ➢ 快 速：＞4周（菌种鉴定） 6 小时 ➢ 灵 敏： 103 个菌/反应
23
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒
田斌等，发光二极管荧光显微镜在基层实验室诊断结核分枝杆菌的应用评价. 实用预防医学2012年10月第19卷第10期.
分枝杆菌培养技术
• 结核菌培养仍是目前诊断的金标准．尤其是药敏 试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具 有重要作用, 是鉴定是否为活菌的可靠方法．
• 1、传统的固态培养法 需要4～6周才能检测到结核菌的生长．而且阳
病原学 免疫学 分子生物学
• 萋尼染色+荧光染色 • 罗氏培养+分枝杆菌快速培养
• 抗原抗体检测 • 细胞因子检测
• 荧光定量PCR • 芯片杂交
涂片镜检--抗酸染色
• 抗酸染色是目前为止最快的结核检出方法， 可用来检测病情进展，为感染控制提供参 考依据，可确证培养物为阳性
• 萋尼染色法—红色—普通显微镜（高倍） • 荧光染色—黄或橘色—荧光显微镜（低倍）
• 体外不能培养。
结核分枝杆菌
• 全球约有1/3的人口已经感染结核分枝杆菌，有 2000万活动性肺结核患者，每年新发病例900万 人，每秒钟有1人感染结核，每年有300万人死 于结核病。
• 随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的 改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降
• 20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌 耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、 贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的 疫情骤然恶化
6
生物学形状
结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，有时可见 分枝状，无芽孢和鞭毛，因衰老或抗结核药物的 作用可出现多形态，如球状、串珠状或丝状， 大小为1～4X0.4μm。
细胞壁中含有大量脂质而不易着色，特别是有 大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，一般 用抗酸染色。萋尼染色呈红色，背景为蓝色； 荧光染料金胺“O”染色，荧光显微镜下为橘黄色
结核分枝杆菌实 验室检测方法
分枝杆菌属
• 一类细长略带弯曲，有时呈分枝状的杆菌，本属 细菌多具有抗酸性，又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus），细菌体内含有分枝菌酸，细胞壁含有 大量脂类，这与分枝杆菌的染色性、抵抗力和致 病性等密切相关。
• 本属细菌已经被鉴定的有70多种，可分为三大类： 结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、麻风分枝杆菌；
基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对
耐多药结核病做出快速诊断。
➢ 通 量：两个一线抗结核药（MDR） ➢ 速 度：8周（药敏） 6 小时 ➢ 灵敏度：103 个菌/反应
24
五种结核检测方法效果评价
涂片法
MGIT 960 快速培养
斑点层析法
结核组：1260例
非结核组：100例
菌时可检出，而培养可检出>10-100条菌.
发光二极管荧光显微镜（LED）
• 荧光显微镜成本高、易损坏、耗电量大、 光源寿命短、显微镜价格昂贵且需要在暗 室内工作等，荧光染色法一直没有在结核 病痰涂片诊断中得到广泛的应用。
• 只需将二极管替换普通光学显微镜的目镜 就相当于一台荧光显微镜，组装的“荧光 显微镜”结合金胺O染色在结核病痰涂片检 查中有一定的应用价值。
• 对活动性结核的诊断灵敏度高达77％，
Biblioteka Baidu
局限性：
• 假阴性： • 小儿结核、老年人结核、免疫缺陷或免疫
功能低下患者（如合并HIV感染、接受免疫 抑制剂治疗的患者) • 假阳性： • 接种过卡介苗的人也会产生阳性反应
γ干扰素释放试验
被认为是近十年来结核诊断史上取得的最重 要成就，该检测方法的原理是：结核感染后 体内长期存在抗原特异性的记忆性Ｔ 细胞， 当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增值， 释放γ干扰素。 •目前市售两种， QFT-G和T-SPOT.TB，比 较两种方法， T-SPOT.TB更灵敏但QFT-G更 特异，但均优于结核菌素试验，同时也被推 荐用于潜伏结核诊断。
• 结核分枝杆菌属于缓慢生长分支杆菌
非典型分枝杆菌
• 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌龟/脓肿、胞内分枝杆 菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆 菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆 菌、土分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、 海-溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆 菌、蟾蜍分枝杆菌等
固体培养和液体培养优缺点
• 固体培养：污染少，易于进行菌落形态观 察，但是培养时间长
• 液体培养：菌体与培养基充分接触，生长 迅速，但易受到污染
血清学试验
免疫学检测方法
• 1、结核菌素试验 • 凡感染过结核杆菌的机体，会产生相应的
致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能 力，当再次遇到通过皮肤注入的少量的结 核菌素时，致敏Ｔ 淋巴细胞受相同抗原再 次刺激会在48-72小时内，产生局部炎症反 应，出现红肿硬节即为阳性反应。
培养特性
培养基
• 营养要求高，必须在含血清，卵黄，马铃薯，
甘油及无机盐类的特殊培养基上生长，常用的 有罗氏固体培养基
• 专性需氧，3%-5%CO2能促进其生长最适温 培养条 度为35-37℃，最适pH为6.5-6.8
件
• 菌落粗糙型，表面干燥成颗粒状，不透明，乳
菌落特 点
白色或淡黄色，菜花样
8
实验室检测方法
分子生物学检测方法
• 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发 展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验 提供了极大的方便，可将诊断时间从几周 降低到几天。研究、应用报道较多的结核 病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应 (PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基 因芯片、基因分型等。
分枝杆菌分子诊断系统（协和医院）
改良罗 氏培养
荧光 PCR
结果比较
高会霞等，五种结核病实验室检测方法对结核病诊断价值的 效果评价.实用检验医师杂志，2012，4（3）：157-160.
敏感性、特异性比较
罗氏培养和快速培养
快速培养和荧光PCR
总结：
• 涂片简单快速但阳性率较低、难以区分结 核和非结核分枝杆菌
• 培养为金标准，但需时较长 • 血清学试验检测结核抗原或抗体不太理想 • γ干扰素释放试验能较好地为临床服务 • 荧光PCR检测结核分枝杆菌具有较好的敏
性率也只有30％-40％；特异性差．各种分枝杆菌均 可生长。要确定是否为结核菌．需结合分枝杆菌菌 种鉴定和药物敏感性试验。
2、分枝杆菌快速液体培养技术
• BD公司推出的BACTEC—MGIT 960全自动 分枝杆菌培养，鉴定／药敏系统，操作简 便，阳性标本检出时间平均为9d：鉴定、 药敏试验时间平均为4d：阳性标本检出率 比传统固体培养提高10％左右
实时荧光PCR
基因芯片快速检测平台
分枝杆菌核酸检测
分枝杆菌菌种鉴定
结核分枝杆菌耐药基 因检测
筛查、鉴别诊断
菌种鉴定
MDR早期诊断
分枝杆菌核酸检测
功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断
➢ 高 效： 一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM ➢ 快 速： 4周（菌培） 3 小时 ➢ 灵 敏： 10 个菌/反应（TB）；102 个菌/反应（NTM）
• 按生长速度可分为三类，即缓慢生长菌、迅速生 长菌和不能培养菌三种类型
结核分枝杆菌群
• 结核分枝杆菌，是人和动物结核病的病原体，包 括人结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、非洲 分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌 （M.microti），前三种对人类治病，其中人型结 核分枝杆菌感染发病率最高。