植物单宁的含量测定方法

植物单宁的含量测定方法1 植物单宁单宁（Tannins）又称单宁酸、鞣质、鞣酸。

按Bategnt的定义，指相对分子质量为500~3000的能沉淀蛋白质、生物碱的水溶性多酚化合物。

主要应用于[1]医药、食品、制革、日用化学品、水处理等领域。

单宁在传统医药上内服可治胃肠道出血和止痢，外用于局部止血和创面保护防止感染发炎；近年研究发现单宁还具有抑菌抗病毒、抗过敏、抗氧化和延缓衰老、预防心血管疾病、抗肿瘤和促进免疫等作用。

单宁在食品行业中可作为功能性成分用于制作保健品，生产食品添加剂、风味剂等；在化妆品中主要起收敛、防晒、美白、抗皱、保湿、防腐等作用；在制革工业中，单宁是栲胶的主要成分。

2 单宁的含量测定经典的有皮粉法、干酪素法、氧化滴定法、分光光度法等；现阶段涌现出许多新型的测定方法，如高效液相色谱法、流动注射分析法、原子分光光度法等。

2.1 经典测定方法2.1.1 皮粉法皮粉法是国际上公认的单宁含量测定方法，从 20 世纪 60 年代至今，原苏联、日本、印度和中国都采用此法作为国家标准测试方法。

皮粉的主要成分是蛋白质，单宁是多元酚类，分子中的酚羟基与蛋白质的酰胺键以氢键结合形成不溶于水的沉淀，以此使单宁沉淀下来，用重量法测定其含量。

根据皮粉与单宁溶液接触方式不同，可将其分为震荡法和过滤法。

震荡法是皮粉与单宁溶液一起震荡来脱去溶液中的单宁；过滤法是将单宁溶液流过皮粉柱层以脱去单宁。

通常，过滤法所测的单宁含量比震荡法高5%～7%。

皮粉法所测的是单宁的绝对含量，并且不需要标样，操作简单，可用其测定中药水提液中鞣质的含量[2]。

但皮粉法的缺点是，用重量法测定样品时，须经过过滤、干燥、称重，样品耗用量大，测定时间较长，一般样品分析需20 h 左右，不适合大批量样品的快速测定；没有选择性，对低相对分子质量的多酚也具有一定的吸附能力，往往使测定结果偏高；适用于单宁含量高的样品，不适合低含量和微量测定；另外皮粉试剂的供应和质量都较难保证。

针对以上缺点，现在大多采用皮粉-分光光度法[3]、磷钼钨酸-皮粉比色法[4]等，具有操作简单、快速、精密度高的优点。

2.1.2 干酪素法干酪素的主要成分是酪蛋白，为含磷蛋白。

利用其能选择性地结合具有生理活性的鞣质，从而测定具有疗效鞣质的含量。

干酪素法一般与分光光度法结合，鞣质在一定的pH 条件下与Folin 试剂反应，并且鞣质含量与吸光度成正比。

很多人利用干酪素法测定了金樱子、侧伯叶、大黄、旋覆花[5-8]等药材中单宁的含量，此法样品取量少、简单、灵敏、快速、准确，可作为检测植物药材质量标准的可靠分析手段。

2.1.3 胶体滴定法胶体滴定法，又称聚电解质滴定法，是利用一些电荷密度已知且性能比较稳定的阴、阳离子聚电解质作为标准溶液，对被测试样进行电荷测量的一种滴定方法[9]。

1948 年日本学者寺山宏提出后，经众多研究者的不断改进，已成为最简单的定量分析聚电解质的方法[10- 11]，并且在制革、水处理、造纸、食品等行业得到了广泛的应用[12-13]。

单宁溶液在一定的条件下呈胶体状态，胶粒带负电荷[14]。

胶体滴定的具体做法是[15]，于浸提的栲胶溶液中加入过量的PD（聚二甲基二烯丙基氯化铵）标准溶液，以TB（甲苯胺兰指示剂）为指示剂，用PVSK （聚乙烯醇硫酸钾）滴定过剩的PD。

TB 指示剂带有正电荷，与PD 不反应，最初呈现蓝绿色。

随着滴定的进行，过剩的PD 会与PVSK 形成聚离子复合物，此时再滴入的PVSK 与指示剂反应，产生异染现象，试样溶液立即变为红紫色，指示滴定到达终点。

庞燕等[16]利用胶体滴定法测定木麻黄树皮中的单宁，得出了在pH 为7 时木麻黄溶液的胶体滴定值与所含单宁含量的线性关系，相关性良好，可以据此来计算未知浓度的木麻黄提取液中单宁的含量。

戴丽君等[17]以胶体滴定法和皮粉法分别测定了橡碗栲胶中单宁含量，两者对比发现，胶体滴定法测得的单宁含量值均小于皮粉法的测定值，但是差值不大，究其原因，可能是由于滴定终点的判断、温差等原因引起的。

2.1.4 络合滴定法络合滴定法是以络合反应为基础的容量分析方法，又称螯合滴定法。

单宁分子中含有多个酚羟基可以与一个中心离子，如铜、锌、铋、铁、汞等进行络合，形成多核络合物，在一定的pH 条件下沉淀，再通过EDTA 反滴定过量金属离子来确定单宁的含量。

络合法所使用的指示剂一般为金属指示剂，指示终点到达时要求具有较深的颜色，如铬黑T。

利用Zn2+ 只与单宁反应的特性来沉淀分析溶液中的塔拉单宁，以铬黑T 作指示剂，用EDTA 溶液滴定剩余的Zn2+，结果显示塔拉中单宁的质量百分含量为57.3%，比皮粉法测定的结果要精确[18]。

刘佳铭[19]用Pb2+与单宁络合，以K2CrO4 为指示剂，PAM（阳离子型聚丙烯酰胺）为终点增敏剂，测定了黑荆树栲胶中单宁的含量，较之皮粉法快速、准确。

还有人研究了绿茶[20]、橡子[21]和三叶委陵菜[22]中单宁的络合滴定，众多研究表明络合滴定法简单、快速、误差小，并且避免了沉淀转移及洗涤的繁琐程序，还可省略空白对照，对酚类物质的选择性比较好，蛋白质和抗坏血酸均不影响测定。

但是金属离子与酚类物质的反应与酚的结构有很大关系，并且灵敏度较差，不适宜酚组分复杂的样品。

2.1.5 氧化滴定法氧化还原滴定法是以氧化剂或还原剂为滴定剂，直接滴定一些具有还原性或氧化性的物质；或者间接滴定一些本身没有氧化还原性，但能与某些氧化剂或还原剂起反应的物质。

单宁是多酚类的化合物，具有很好的还原性，在常温酸性溶液中可被高锰酸钾氧化，由此可得到单宁的含量。

用此法测定二白圆、二梭子两种青果果实中的总鞣质含量[23]表明，滴定终点不易观察，须多次平行试验，取平均值。

2.1.6 Stiasny 法Stiasny 法也称甲醛缩合法，是利用单宁与甲醛-盐酸共沸时，单宁与甲醛缩聚，基本上全部沉淀下来。

其反应方程如图1。

单宁与甲醛所产生的沉淀物质量占样品总质量的百分率，称为甲醛值（或称 Stiasny 值）。

在规定的测定条件下，用甲醛缩合的沉淀物质量与试样的质量及不溶物含量之间的数量关系计算得出被测试样中单宁的含量。

国内有采用甲醛缩合法测定落叶松树皮、黑荆树栲胶 [24- 26]中的单宁含量，具有简单、快捷、准确的优点，是一种值得推广的缩合单宁含量的测定方法。

2.1.7 分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长或一定波长范围内光的吸收度，以此对该物质进行定性和定量分析的方法。

分光光度法的应用光区包括紫外光区、可见光区、红外光区，其中常用的是紫外光区和可见光区，两者的波长范围分别为 200 ～400 nm 和 400～760 nm 分光光度法的基本原理是朗伯 - 比尔定律，即当一束平行的单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比。

定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况，从中确定出最大波长，然后以此波长为光源，测定一系列已知浓度 c溶液的吸光度 A，做出 A- c 工作曲线。

分析未知溶液时，根据测量的吸光度，对应工作曲线即可确定出相应的浓度。

在众多单宁含量的测定方法中，分光光度法的应用最为广泛。

常用的显色剂有邻二氮菲 -铁（Ⅲ）、香草醛、正丁醇 - 盐酸、Folin- Denis 试剂、Folin- Ciocalteu试剂、铁氰化钾（普鲁士蓝法）、磷钼酸 - 钨酸钠、柠檬酸铁铵等[27- 31]。

其中 Folin- 酚法和普鲁士蓝法测定的是总酚含量；香草醛法选择性测定 A 环为间苯三酚的黄烷醇，但不能区别单体和聚合体；正丁醇 - 盐酸测定的是聚原花色素（缩合单宁）的含量。

武予清等[32]通过 Folin 酚还原法、正丁醇 - 盐酸法和香草醛法测定棉花组织中单宁的含量，比较表明 Folin 酚法测定的单宁含量值显著高于正丁醇 - 盐酸法，原因可能是此法测定出的是相对总酚含量；而香草醛法的测定结果与正丁醇 - 盐酸法差异不大，可以用于棉花中缩合单宁的含量测定。

2.1.8 比色法比色法是通过比较或者测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。

其作为一种定量分析方法，大约开始于 19世纪 30～40 年代。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，都是以朗伯 - 比尔定律为基础的。

在 20 世纪 30 ～60 年代，是比色分析发展的繁盛时期，它广泛的应用于冶金、地质、金属材料中微量的金属和部分非金属元素的测定。

但随着光学仪器制造技术的发展，分光光度法逐渐代替了比色法。

2.2 现代测定方法2.1.1 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）又称高压液相色谱、近代柱色谱，是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例混合的溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。

1906 年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”和“色谱图”的概念。

1960 年中后期，液相色谱开始活跃，到 60 年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC；1990 年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，促进了它的迅速发展。

高效液相色谱中的固定相可以是液体、吸附剂、离子交换剂、离子交换树脂、凝胶，固定相的不同，分离原理也有差异。

较常用的是液 - 液分配色谱法，即流动相和固定相都是液体，并且互不相溶，有一个明显的分界面。

其又包括正相液 - 液分配色谱法即流动相的极性小于固定相、反相液 - 液分配色谱法即流动相的极性大于固定相。

在液 - 液分配色谱中尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液仍不可避免的在流动相中有微量的溶解；并且流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液的流失。

20 世纪 70 年代末发展的化学键合固定相可以克服上述的缺点，现在应用很广泛。

郭佳莉等[33]采用 Hypersil ODS（125×4.0 mm，5 μm）色谱柱；检测波长 275 nm；流动相为 80%甲醇和 20%水；流速为 0.5 mL·min- 1 测定余甘子中单宁酸的含量，相关系数达 99.996%以上，充分显示了该法快速、方便、精确可靠的优点。

2.2.2 流动注射法流动注射分析法（FIA）是丹麦科学家于 1974 年创立的一项溶液自动在线处理及测定的现代分析技术。

1988 年 Ruzicka 等对流动注射分析作了定义：向流路中注入一个明确的流体带，在连续非隔离载流中分散而形成浓度梯度，从此浓度梯度中获得信息的技术。