新生大鼠心肌细胞培养技巧
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的细胞类型，对于心脏生理学和病理学研究具有重要意义。
在研究心脏疾病发生发展机制、药物筛选及分子生物学研究中，大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是必不可少的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）动物：健康的大鼠（2）工具：手术刀、剪刀、镊子、针头、离心管、培养皿等（3）试剂：PBS、Hanks液、COLLAGENASE、TRYPSIN、DNA酶I2. 心肌细胞的分离（1）准备心肌组织：选取健康的大鼠，进行心肌组织的分离。
将动物取出心脏，迅速放入含有PBS的离心管中，冷藏备用。
（2）组织的机械分离：将心脏取出后进行机械分离，去掉多余的结缔组织等。
（3）酶消化：将组织加入COLLAGENASE、TRYPSIN等酶进行消化，使细胞释放。
（4）滤网过筛：将酶消化后的组织经过滤网过筛，得到心肌细胞的悬液。
（5）细胞纯化：使用密度梯度离心法或其他方法对心肌细胞悬液进行纯化，得到较纯的心肌细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定（1）显微镜观察：将得到的心肌细胞悬液放入培养皿中，通过显微镜观察心肌细胞的形态。
（2）心肌细胞的特征：心肌细胞具有两个或多个横纹和中央的单核的细胞核，且具有特殊的形状和排列方式。
2. 免疫细胞化学鉴定（1）选取适当的心肌细胞标记物：如肌球蛋白、酸性肌球蛋白等（2）进行免疫细胞化学染色：使用特异性抗体对心肌细胞进行染色，观察标记物的表达情况。
（3）通过显微镜观察：观察心肌细胞的染色情况，以确定其特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）培养基配方：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素+适量营养因子（2）pH值调节：将配制好的培养基进行pH值调节至7.42. 大鼠心肌细胞的培养（1）培养皿涂层：将培养皿内涂覆明胶或胶原等基质蛋白，有利于细胞的附着生长。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是研究心脏发育、疾病以及药物筛选的重要方法。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离方法、鉴定和培养条件。
1. 心肌细胞的分离器械准备：a. 心脏灌注系统：可以使用经过消毒的大鼠心脏外来供血灌流系统，灌流液为糖酸盐缓冲液（pH=7.4），温度为37℃。
b. 心脏切片工具：可以使用经过消毒处理的手术刀片和镊子。
2. 大鼠心肌细胞的分离步骤：a. 合适年龄和体重的健康大鼠，进行全麻处理（如异氟醚麻醉），并用顺风消毒剂进行消毒处理。
b. 快速取出心脏，将心脏放入含有糖酸盐缓冲液的灌流系统中。
c. 快速连接灌流系统，将糖酸盐缓冲液从左心房注入，以去除血液和离心区域的细胞。
d. 用含有酶的灌流液灌入，如含有胰酶、胶原酶和镁离子的消化液，同时加入适量的钙离子。
e. 离心和留取心肌细胞上清液，心肌细胞沉淀在离心管的底部。
1. 大鼠心肌细胞的鉴定器材准备：a. 活体显微镜：用于观察和记录心肌细胞的形态特征。
b. 细胞培养物皿：用于观察和记录心肌细胞的生长情况。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定步骤：a. 取适量的心肌细胞上清液，将其转移到培养皿中。
b. 使用活体显微镜观察心肌细胞的形态特征，如是否有纤维形态、异型心肌细胞、连接融合而成的网络等特征。
c. 使用显微镜观察心肌细胞的生长情况，如是否有脱落、生长迅速、形成网络等特征。
1. 培养基溶液的配制：a. 培养基条件：可以使用生长因子和胎牛血清进行补充，以促进心肌细胞的生长速度和功能发育。
b. 培养基液配方：常见的培养基液配方主要包括DMEM/F12、MEM、RPMI1640等。
2. 大鼠心肌细胞的培养步骤：a. 取适量的培养基液，加入适量的生长因子和胎牛血清。
b. 将心肌细胞沉淀悬浮于培养基液中，设置悬浮液的浓度。
c. 将培养皿置于带盖的离心转盘中，充分培养细胞。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是一个复杂而关键的过程。
通过合理选择器械和条件，可以成功地获得纯度高、活力好的大鼠心肌细胞，为研究心脏相关疾病的机制和治疗提供可靠的细胞模型。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的研究对象，分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是进行相关研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养方法。
1. 大鼠心肌细胞的分离方法：a. 准备消化液：将含有0.1%胰酶和0.05%胰蛋白酶的耗氧培养液(如DMEM/F12)预先加热至37℃。
b. 杀死大鼠：快速杀死大鼠，并立即进行心肌细胞的分离。
c. 开胸取心：通过剖开胸腔，将心脏暴露，并迅速取出。
d. 剪开心脏：用剪刀切开心脏的心室部分，将其放入预先加热的消化液中。
e. 贴壁处理：将心室组织液搅拌均匀，并放置在37℃培养箱中酶解。
每隔10分钟，用吸球轻轻吸取上清液，反复操作3-4次。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定方法：a. 形态学观察：用显微镜观察分离得到的心肌细胞的形态，心肌细胞呈长条状，具有明显的纵纹和横纹。
b. 钙离子荧光染色：使用荧光染料如Fluo-4 AM来标记细胞内的钙离子，并观察细胞内钙离子的动态变化。
c. 免疫荧光染色：使用心肌细胞特异性标记物如肌球蛋白进行免疫荧光染色，观察标记物的染色情况。
3. 大鼠心肌细胞的培养方法：a. 培养基准备：将DMEM/F12培养液加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液和1%胎牛血清补充物。
b. 细胞接种：将分离得到的心肌细胞加入培养基中，浓度为1 * 10^5 cells/ml，并将细胞悬浮液加入培养皿中。
c. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5%。
d. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养基，同时可添加适量的生长因子和激素。
e. 心肌细胞传代：当心肌细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代。
传代方法与培养方法相似，注意细胞的保持适当的密度。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是大鼠心肌细胞研究的关键步骤。
通过合适的操作和条件，可以获得纯度较高的心肌细胞，并进行相关研究。
需要注意的是，心肌细胞的分离和培养过程需要在无菌条件下进行，以避免细菌和其他微生物的污染。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞是心肌细胞的主要来源之一，在心脏疾病的研究中具有非常重要的作用。
为了开展相关研究，需要对大鼠心肌细胞进行分离鉴定以及培养，以下是一份详细的操作
步骤。
1. 器材准备
（1）无菌试剂：试剂瓶/管、离心管、移液器、细胞培养基等。
（2）消毒器材：无菌吸管、离心机、高压灭菌器、悬浮液制备仪等。
（3）实验器材：显微镜、培养箱、细胞计数板、细胞离心机等。
2. 心肌细胞的分离
（1）准备新鲜的大鼠心脏组织。
（2）将心脏组织放入离心管中，加入PBS洗涤1-2次。
（3）将心脏组织切成小块，加入预先调配好的组织消化液（如DMEM/F12加入胰蛋白酶），37℃放入恒温水浴中消化2-3次。
（4）将消化的样本离心，去除上清液，加入预备的培养基，悬浮细胞。
（5）进行筛选，并将心肌细胞分离，最终得到心肌细胞。
（1）将分离好的心肌细胞放置在显微镜下观察其形态。
（2）进行免疫荧光染色，使用特定的心肌细胞抗体进行染色，观察细胞核及膜表达，判断其是否为心肌细胞。
（1）将鉴定好的心肌细胞放入预备好的细胞培养基中。
（2）放置于37℃恒温培养箱中，维持培养基液位。
（3）每2-3天更换一次新的培养基。
以上就是大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的操作步骤，具体操作时应注意操作规范
和实验安全，保证实验结果的准确性和可靠性。
大鼠心脏细胞的制备与培养
大鼠心脏细胞的制备与培养新生鼠心脏细胞不具备繁殖能力，故不行能传代，只能利用原代培养物。
心脏细胞培养物易受培养技术水平及处理条件的影响，例如，新生鼠心肌组织对酶消化处理极其敏感。
心肌细胞培养碰到的另一个普遍的问题是成纤维细胞的污染，繁殖的成纤维细胞能很快从数量上压倒心脏细胞并可能影响到心脏细胞的分化，由于成纤维细胞普通比心脏细胞更易贴壁。
若需长时光培养心脏细胞，应施以诸如（ ethidium bromide, EB) ,溴脱氧尿昔( bromodeoxyuridine, BrdU）等化学处理，用法不同的血清，如牛血清，能降低成纤维细胞的繁殖速率也能增强心脏细胞的收缩性能。
另外，应考虑的问题是合适的接种密度，以保持健康跳跃的培养物。
心脏细胞培养物的伸缩性似乎和细胞与细胞之间接触有些关系，尽管形成一个融合成片的心脏的单层培养物极其困难。
借助于化学处理，如施以去甲肾上腺素，或加入牛血清可以提高细胞的伸缩性。
【材料】1．组织来源幼鼠(0～1日龄Sprague Dawley幼鼠)20～25只。
2．培养基与试剂 (1）消化液：90％加Earle's盐液的MEM，加10% FBS,O.1 %；(2）盐水A：137mmol/L NaC1,4mmol/L KC1,4.2mmol/L NaHC03、5mmol/L；(3）接种培养基：90％加Earle's盐的MEM,10% FBS、1001U/ml，100ug/ml，加有血清的培养基必需在30天内用法完毕； (4）交换培养基：90％加Earle's盐的MEM,10％牛血清、100IU/ml、100ug/ml，加有血清的培养基应在30天内用法完毕。
3．器具各种吸管、离心管、三角烧瓶、烧杯，培养皿，冰台（将一只平皿装满冰后倒置即可）。
【办法】 1．组织消化和分别细胞 (1)取一只整洁加盖烧杯，内放一块Metofane饱和的纱布，把幼鼠放烧杯中麻醉（20只幼鼠大约需要5分钟）。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是生物医学研究中常见的实验步骤。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 准备工具和试剂- 离心管、培养皿、组织研磨器、离心机、反应管等；- 消化酶（如胰蛋白酶、胰酶、胶原酶）、细胞分离缓冲液（如Hank's液、DMEM/F12液）- 磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、PBS缓冲液等。
2. 动物安乐死和心脏取出- 通过适当的麻醉方法将大鼠处死；- 固定大鼠，将心脏迅速取出。
3. 大鼠心脏组织的处理- 将心脏放入含有预冷的磷酸盐缓冲液的离心管中；- 用螺旋式切割器将心脏切碎并加入含有消化酶的组织研磨器中；- 用搅拌器均匀搅拌、体外消化。
4. 细胞的分离和纯化- 将组织胶块转移到筛网上，用PBS缓冲液冲洗细胞；- 收集细胞上清液，离心沉淀；- 用细胞分离缓冲液重新悬浮沉淀细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 大鼠心肌细胞鉴定试剂- 法斯琪染色试剂；- cTnI、cTnT等心肌特异标志物抗体；- 免疫荧光显微镜。
2. 法斯琪染色鉴定- 采用法斯琪染色方案对心肌细胞进行染色；- 使用显微镜观察是否出现蓝色染色反应，标志细胞为心肌细胞。
3. 免疫荧光鉴定- 使用抗体与心肌特异标志物结合；- 使用免疫荧光显微镜观察细胞是否出现荧光信号。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 大鼠心肌细胞的培养基- 常用的培养基有DMEM/F12液、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）等。
2. 细胞培养条件- 培养基中添加适当的血清（如胎儿牛血清）和抗生素；- 培养箱中保持37℃、5% CO2含量。
3. 大鼠心肌细胞培养步骤- 将分离得到的心肌细胞加入培养基中；- 在培养箱中培养细胞，定期更换培养基；- 进行细胞观察和实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种可供研究心脏疾病和相关生理学过程的重要模型细胞。
分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞对于心脏病研究具有重要意义。
本文将详细介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定方法以及培养步骤。
1. 动物准备根据实验需要选择2-3个月大的健康雄性大鼠。
提前饲养大鼠，使其适应实验环境，避免压力引起心肌细胞损伤。
实验前一天，禁食12小时但允许饮水。
2. 心肌细胞分离将大鼠按麻醉操作，使用90mg/kg的琥珀胆碱或90mg/kg的乙酯进行麻醉。
确认大鼠麻醉后，通过软组织剪刀取出心脏，将其置于冷却的Buffer A中。
(Buffer A: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES的PBS液)将心脏移至工作台上，用毛刷清洁心脏表面的血液和附着物。
然后将心脏转移至10cm 培养皿内，将血管外壁剪除。
将心房和心尖切掉，将心脏切割成小块，并转移到15 mL离心管中。
加入5 mL Buffer A，并使用移液器缓慢混合。
使用1000 rpm进行梯度离心 (5 min)。
根据实验需要，可以选择制备低密度（20%离心液缓冲液）或高密度（50%离心液缓冲液）梯度离心。
将上清液去除，将沉淀与Buffer A混合。
将混合液过滤，去除残留的大块异物。
可使用0.22 μm的滤膜将上清液过滤。
收集上清液至50 mL离心管中，离心10 min(1000 rpm)。
去除上清液，保留沉淀。
再次挤压沉淀，使其成为小碎片。
将沉淀与37°C的Buffer B液混合。
(Buffer B: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM taurine, 10 mM BDM的PBS液)以500 rpm离心5 min，去掉上清液，保留沉淀。
大鼠原代心肌培养
新生大鼠原代心肌培养需高压消毒：工具盒：小转子；300目滤网×2；眼科剪（直剪×1，弯剪×2）；枪头盒（1mL、200μL、20μL）。
需提前配制并4⁰C预冷：D-Hank’s稀释的0.1%胰酶；加双抗的PBS。
1．麻醉与消毒：麻醉1-3天新生大鼠并用75%酒精浸泡消毒。
2．解剖：剪开胸腔，立即取出跳动的心脏并放入冰冷的PBS（加双抗）中，切取心室并转移到另一新鲜冰冷PBS中，初步洗去心室内的血液后将心室剪成1-3mm3的碎块，短暂离心几次，以去除红细胞。
注：所有操作在冰上进行。
注意防止污染。
红细胞会影响心肌细胞的贴壁。
3．预处理（20min）：将切碎的组织转移至0.1%胰酶溶液（0.5ml/1心脏）的40ml 培养瓶中（含转子，），置于冰上20min，每3min摇动一次。
注：这一步中使胰酶充分浸润组织块，以利于后续消化。
4．胰酶消化（15min）：将培养瓶置于37⁰C水浴15min，150-200rpm搅拌。
注：胰酶应为D-Hank’s配置，与PBS配置的相比，更利于心肌细胞的存活和贴壁。
5．吸取上清：将上步中的培养瓶斜放静置后，小心吸取上层的细胞悬液，移至50ml离心管（预先加入5-10ml含10%FBS的DMEM培养基）中，终止胰酶作用。
收集的细胞悬液置于4⁰C冰箱。
注：尽量吸取上清，不要吸到下层粘稠的DNA或者组织块。
6．重复消化：向培养瓶中补充胰酶，重复步骤4、5，直至组织块基本消化干净。
7．收集细胞：将所有上述收集的细胞悬液1000 rpm 5min收集细胞，将细胞种植于100mm培养皿中进行预贴壁培养。
8．细胞纯化（1.5-2h）：将步骤7中所得细胞培养1.5-2h以使非心肌细胞贴壁，然后将剩余细胞悬液以5×105个/ ml的密度种植于6孔板或100mm培养皿中，加BrdU至终浓度为0.1mmol/L，培养48小时以防止非心肌细胞增殖。
48小时后，更换不添加BrdU的DMEM培养基进行培养。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心血管疾病和心脏发育机制的重要模型。
在进行心肌细胞的分离鉴定和培养之前，我们需要准备以下实验材料和试剂：酶消化液、细胞培养基、大鼠心脏。
我们需要将大鼠处死，并将心脏取出。
取出的心脏需要立即放入含有乙醇消毒的PBS缓冲液中，以去除血液和外部污染物。
然后，将心脏移入无菌培养皿中，用PBS缓冲液冲洗数次，确保心脏表面干净。
随后，用取决于细胞类型和实验目的的酶消化液，如胰酶和胶原酶混合物溶液，对心脏进行消化。
消化时间可能需要根据实验目的的不同而有所差异，通常为30-60分钟。
在消化过程中，可以用显微镜观察和记录细胞的释放情况。
消化结束后，用完整培养基将消化产物传递到细胞培养皿中。
细胞培养皿需要经过预处理，用缺血的培养基包裹，并在37摄氏度的恒温培养箱中进行预暖。
将消化产物收集到离心管中，并用完整培养基进行离心，以去除酶消化液和细胞碎片。
离心结束后，将上清液抛弃，细胞沉淀用预热的完整培养基进行重悬。
通过显微镜观察细胞的形态和数量，并计算细胞的产量和存活率。
对于心肌细胞的鉴定，我们可以使用免疫荧光染色、流式细胞术等方法。
通过使用心肌标记物，如心肌肌动蛋白、酒石酸可溶性酸酐酶等，我们可以确保分离得到的细胞是心肌细胞而不是其他细胞类型。
在培养心肌细胞时，我们可以使用培养基中添加特定生长因子和血清的方法来促进心肌细胞的增殖和存活。
在培养过程中，需要定期更换培养基，并进行细胞观察和记录。
注意细胞的形态变化，如细胞肥大和收缩、形成心肌样结构等。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏的主要细胞类型，其功能是维持心脏的收缩和舒张运动。
由于心肌细胞自身的特殊性质，其在病理学和药理学研究中具有重要的作用。
因此，对大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养具有重要的研究价值。
1. 材料与方法将健康的雄性SD大鼠用5%碘酒消毒，取出心脏并用PBS清洗，然后将其切成5mm×5mm的小块。
接着，将心肌块用0.25%胰酶和0.1%胆酸溶液（pH 7.4）在37℃水浴中消化30 min，然后加入完整培养基中停止消化。
用100μm的过滤网过滤后放在离心管中，500g离心5 min，取出混悬液上清液（含心肌细胞）。
将上清液平行于低浓度FBS培养基缓慢滴加到细胞培养瓶中，放置于37℃恒温培养箱中培养。
将细胞瓶中的细胞制备成单层细胞，加入适量的鼠抗α肌动蛋白单克隆抗体进行免疫染色。
观察细胞的形态和免疫染色结果，确定大鼠心肌细胞的纯度。
同时，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting等方法来检测心肌特异性基因和蛋白的表达水平。
1.3 第1代大鼠心肌细胞的培养将细胞瓶中的心肌细胞培养至80%的密度后，用0.25%胰酶溶液（pH 7.4）将细胞处理成单细胞，然后加入适量的完整培养基中，调整至适当的离心管中，进行离心操作。
沉淀细胞，再用适量的完整培养基悬浮细胞，取适量的细胞悬浮液加入到新的细胞培养瓶中，以此种方式连续传代，获得第1代大鼠心肌细胞的纯培养状态。
2. 结果通过以上方法，从大鼠心脏中成功分离出心肌细胞，得到了悬浮液。
悬浮液中的心肌细胞大小大约为10-15μm，可用影像学方法进行精细观察，获得细胞数量约为3×10^6个/ml。
通过α肌动蛋白的免疫染色和心肌特异性基因和蛋白的表达水平的检测，我们成功地鉴定出了大鼠心肌细胞的纯度，并且进一步证明了其心肌细胞的特异性。
通过培养，我们成功地获得了第1代大鼠心肌细胞的纯态，细胞生长状况良好，细胞数量增加较为显著。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏肌肉的主要细胞类型，具有重要的生理功能。
研究大鼠心肌细胞具有重要的意义，可以探究心血管疾病的发生和发展机制，以及开发相关的药物治疗。
大鼠心肌细胞的分离可通过以下步骤进行：1. 预处理：取出大鼠心脏，迅速放置在冷却的维生素-free Hanks盐溶液中。
然后，用冷却过的Hanks盐溶液洗涤心脏，去除血液和杂质。
2. 细胞分离酶处理：将心脏切成小块，并放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%胆汁酸的预温化酶解缓冲液中。
在37℃的恒温摇床上进行酶解处理。
3. 细胞分离：酶解后的心脏组织经过轻微的摇晃，并用玻璃棒将组织块轻轻破碎。
将破碎的组织悬浮液通过细胞筛过滤器，并用高离心力离心收集上清液。
4. 细胞沉降：将上清液经过离心，去除上清液，留下细胞沉淀。
再次加入含有0.1%胰蛋白酶的预温化酶解缓冲液，并摇动细胞沉淀，使细胞悬浮。
5. 细胞富集：采用密度梯度离心法，将细胞悬液慢慢加入含有离心液的离心管中进行离心。
心肌细胞将沉积在密度梯度的底部。
6. 细胞培养：将心肌细胞的上清液去除，留下沉积的心肌细胞，加入预先准备好的心肌培养基中。
将细胞培养于37℃恒温孵化箱中，并提供适当的营养物质。
1. 形态学鉴定：使用显微镜观察细胞的形态结构。
正常的心肌细胞呈长条状，具有交叉纹理的横纹。
如果细胞形态发生变化，如变形、伸长或成球状，则可能表示细胞出现异常。
2. 免疫细胞化学鉴定：使用免疫荧光染色或免疫组化染色的方法，检测心肌细胞特异性标记物，如肌球蛋白（myosin）等。
正常的心肌细胞应表达这些标记物。
3. 功能鉴定：利用心肌细胞的特殊功能特点，如收缩、钙离子跨膜转运等，进行鉴定。
可通过记录细胞的膜电位变化、细胞的跳动频率等指标来评估细胞功能。
心肌细胞的培养需要特别注意以下事项：1. 培养基的选择：根据不同研究需求选择适当的培养基，如DMEM、Dulbecco改良的培养基等。
培养基应添加适量的血清、营养物质和生长因子，以提供细胞所需的营养和生长环境。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，可以用于研究心肌细胞的生理和病理过程。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养的步骤和注意事项。
一、心肌细胞的分离鉴定：1. 材料准备：- 大鼠心脏- 胰蛋白酶- 培养基（如DMEM/F12）- FBS（胎牛血清）- 抗生素（如青霉素/链霉素）- 生长因子（如胰岛素、培养基因素等）2. 心肌细胞的分离：- 用冰盐水冲洗大鼠心脏，将心脏置于0.1%胰蛋白酶溶液中，37℃恒温水浴放置15-20分钟。
- 取出心脏，去除杂质，用小孔濾网过滤，收集滤液。
- 加入预先冷却的培养基，离心分离细胞。
- 以适当的浓度重新悬浮心肌细胞。
3. 心肌细胞的鉴定：- 用显微镜观察细胞形态，心肌细胞的特点是形状呈纺锤形，具有交叉纹理。
- 心肌细胞可以用荧光染色的方法标记心肌肌纤维，如使用α-肌动蛋白标记。
- 用特异性抗体进行免疫染色，如心肌细胞特异性标志物肌球蛋白T (cTnT)。
2. 培养心肌细胞：- 将分离得到的心肌细胞在含10% FBS培养基的培养皿中培养。
- 培养皿放置于37℃恒温培养箱中，维持5% CO2的湿润环境。
- 每2-3天更换一次培养基，并观察细胞生长情况。
3. 细胞的凋亡和增殖：- 可以通过荧光染色，如使用Dapi染色观察细胞核形态来检测细胞凋亡。
- 可以使用CCK-8法或MTT法来测定细胞增殖情况。
4. 细胞的存活和形态观察：- 可以使用乙酰胆碱酯酶染色来观察细胞存活情况。
- 使用显微镜观察细胞形态的变化和生长状态。
总结：大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，在心脏病等相关研究中有着广泛的应用。
通过使用适当的培养基和条件，合理观察和分析细胞的形态和生理活性指标，可以用于研究心肌细胞的生理功能和分子机制，为心脏疾病的治疗提供基础和参考。
新生鼠心肌细胞培养过程技巧方法
一、材料与设备(一) 实验动物出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。
(二) 实验试剂低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。
培养液：培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
(三) 器械与仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和 50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、实验流程(一) 实验步骤1. 将胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入 0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许 0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成 1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取 2-3 ml 新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是心脏组织中最主要的细胞类型，其具有重要的研究价值和应用前景。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和技巧，以供需要的研究者参考。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 质子化心肌细胞将雄性大鼠（体重200-250g）置于无菌条件下，去毛、消毒，然后迅速取出心脏，置于含有生理盐水的培养皿中。
使用显微镊子和显微刀将心脏分割成小块，使得心肌组织充分暴露。
将小块心肌组织转移至含有0.05%的胰酶和0.1%的胰蛋白酶的新鲜培养液中，温育30分钟至1小时。
温育完成后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基冲洗心肌组织，过滤去除残留的纤维和细胞碎片。
对心肌组织进行胶原酶-胰蛋白酶消化，离心沉淀后获取心肌细胞。
2. 分离和纯化获得的心肌细胞需要经过一定的分离和纯化步骤，以消除其他非心肌细胞的干扰。
常用的分离方法包括稳定梯度离心法、摇床培养法和免疫分选法。
通过适当的分离方法，可以获得较为纯净的大鼠心肌细胞用于后续研究。
1. 形态学鉴定通过显微镜观察大鼠心肌细胞的形态结构，包括细胞形状、大小、核与细胞浆的比例等，进行初步的鉴定。
正常的心肌细胞呈长条状，具有跨膜结构，胞质内含有丰富的线粒体和肌纤维等特征。
2. 免疫细胞化学鉴定通过特异性抗体对心肌细胞进行染色和标记，观察其对特定标记蛋白的表达情况。
常用的标记蛋白包括肌动蛋白、肌球蛋白、心肌肌球蛋白等。
通过免疫细胞化学鉴定，可以明确心肌细胞的特异性。
1. 培养基的选择大鼠心肌细胞的培养通常选用DMEM（Dulbecco's modified eagle's medium）培养基，添加10%的胎牛血清和适量的抗生素。
培养基的pH值应调整在7.2-7.4之间，以及含有必要的营养物质和生长因子。
2. 细胞密度和培养条件将鉴定过的心肌细胞悬浮于培养基中，调整成合适的细胞密度后，接种于预先涂覆明胶质或明胶胱聚糖混合物的培养皿中。
新生Wistar大鼠心肌细胞的分离培养与鉴定
细胞特异性 蛋白（ Ｔ Ｔ 抗 体和 仪肌动蛋 白（ ａｔ ） 克隆抗体 分别对 培养 的心肌细胞 进行免 疫荧光及 免疫 ｃｎ ） —ｃ ｎ 单 ｉ 组织化学鉴定 ， 结果均呈 阳性 。 关键词 大鼠 ， 新生 心肌 细胞 分离培养
随着 心血 管疾 病 在基 础医 学及 临床 医学 研究
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新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏的主要细胞类型，负责心脏机械和电生理活动，对心脏健康具有重要的影响。
因此，研究心肌细胞具有重要的应用价值。
在本文中，将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养技术。
1.1 心肌细胞的分离将大鼠心脏取出，用注射器将缓冲液（如PBS）注入主动脉，以清洗心脏内部的血液。
随后，将心脏移至一盛装有酶消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，肌肉组织被消化成单个细胞。
消化时间一般为20-30分钟，消化程度可以调整。
之后用培养液（如DMEM/F12）中和胰蛋白酶的酶消化液，使消化过程终止。
细胞分离后可以使用显微镜进行观察，同时也可以通过显微镜观察细胞形态来判断分离效果。
大鼠心肌细胞通常采用肌钙蛋白T的免疫荧光染色进行鉴定。
此外还可以使用心肌特异性的基因表达来鉴定心肌细胞。
通过PCR扩增，可以检测到只存在于心肌细胞中的基因，如心肌肌钙蛋白T和肌红蛋白等。
在培养前，需要先将心肌细胞分离、鉴定和计数。
以下是大鼠心肌细胞的培养方法：2.1 培养基适用于大鼠心肌细胞的培养基包括：DMEM/F12、M199、MEM、RPMI 1640等培养基，其中DMEM/F12和M199为常用培养基。
大鼠心肌细胞通常以静态培养为主，营养液一般为12%胎牛血清、5%马血清混合的DMEM/F12培养基。
细胞应在涂有胶原质的培养皿中培养。
培养室温度为37℃，5% CO₂的有利条件下培养。
此外，需要注意的是，心肌细胞对缺氧和低氧非常敏感，因此在培养过程中应始终维持培养皿内的氧气浓度。
通常情况下，大鼠心肌细胞的培养状态可以分为初代培养和传代培养。
初代培养的心肌细胞生长很快，但失去了心肌特异性表达，而传代培养中将保留心肌特异性的表达。
在传代培养时，需要定期检测细胞数量，并在细胞繁殖至80-90%时进行传代。
此外，传代时应注意保持培养基的组成和浓度的稳定，避免对细胞造成损伤。
总之，大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养对于心血管疾病研究具有非常重要的意义。
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新生大鼠心肌细胞培养技巧
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：
1新生大鼠鼠龄的选择新
生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.
2消化酶的选择及使用
新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.
3消化程度的把握
新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意:(1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.
4接种的细胞密度
心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.
5细胞的分散度与接种的均匀性
分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.
6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.
7换液时间
进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.
8抗污染措施
除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.
9培养液pH值
适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.
1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。
后来解剖开后才想起来，本科时候解剖老师说新生儿脏器位置偏低，，，，后来就在大约第5－6肋骨处插入剪刀尖，横向剪开胸骨，大概开口8ｍｍ就可以挤出心脏了。
每取一个心脏大约1ｍｉｎ。
２，培养基的使用，虽然大多数人用的是DMEM高糖培养基，可是又有人用的是1640，同样也有效果（心肌细胞波动良好），同时实验室里也有师兄正使用1640，我就偷懒，就用1640，可是细胞就是不搏动，后来查了资料才知道，1640的钙离子浓度太低，而DMEM钙离子浓度1.8×1000（－3）。
这是比较适合的浓度。
后来我就自己买了DMEM 培养基就可以了，细胞博动的很好看。
３，消化心肌组织是出现絮状物质，没有办法去除，吸出已经消化的细胞时由于絮状物质的干扰不能吸出。
我试着加大离心速率，期待能去除，可是2000rpm*10min离心后，居然它还是悬浮着。
那次消化心肌非常失败，后来有一次在医院食堂吃饭，同桌的一位脑外博士，提到他消化脑组织，消化过渡的时候也会出现，这样的现象，后来经人指点说的细胞破了，DNA出来了。
哦，我才恍然大悟，原来如此。
以前一味得追求心肌细胞消化的彻底，就把心肌组织剪成肉沫状，……。
以后消化的时候就是不能太小了。
４，在园子里提到两种消化方法，一种是用恒温振荡器，一种用磁棒搅拌，原来以为胰酶的合适温度是37度，我用前者，可是消化结果，细胞数量很少，经过8次每次消化8分钟后，剩余的组织块还是很大。
没有办法了，用后者，在室温20度的情况下消化结果好多了。
５，当我把组织都消化了，什么都没有剩余了，我就把那些液体去离心1000rpm*10min（园子里一般推荐用的），可是我发觉：离心下来的细胞非常少，冥思苦想。
后来有人提示说，离心标准单位是用g，大约是350g，我就按半径换算了，结果发现350ｇ应该是1500ｒｐｍ。
于是下一次消化时改用了1500ｒｐｍ，细胞就多了。
不死心，把上清去除继续4000ｒｐｍ离心，发觉还是有细胞剩余，不过这些细胞台盼蓝染色存活率比较低约40％
以上这些与大家共同讨论，谢谢。
我也是个新手，希望大家能互相帮助。
大鼠心肌细胞分离
大鼠心肌细胞比乳鼠心肌难养，用无血清培养基，呈杆状，横纹清楚，在培养基里细胞不搏动。
大鼠心肌细胞分离一般是采用二型胶原酶分离，浓度为1mg/ml（用无钙台氏液配制），同时酶液里加入牛磺酸，BSA。
一般采用Langendorff灌流的方法，大鼠开胸后，迅速取出心脏，放入冰的台氏液中，找到主动脉后，挂上Langendorff装置，衡流泵灌入无钙台氏液（37度），开始心脏会搏动几下，这样把心脏中的淤血挤出（此处也有人用有钙台氏液灌流，好让心脏充分搏动，把淤血挤出，不过我们摸索发现只要取心脏到挂上去的时间短，一般搏动几下就能把淤血清楚干净了）。
几分钟后，换酶液开始灌流心脏，一般开始时，心脏较软，待消化一段时间后变硬，继续消化后又变软，且心脏发白，这时候就可以停止消化，将心室剪下，放入KB液中，用剪刀剪碎后，用滴管吹打，取上清，继续加入KB液，吹打，直到上清液不浑浊为止，一般吹打3－4次即可。
将各次上清合并，吹打过滤后，沉降20分钟左右，弃上清，加入无血清培养基（MEM，不含L－谷氨酰胺，并加入肌酸，牛磺酸，BSA，肉毒碱，HEPES），吹打，1000转/分离心半分钟，弃上清，再洗1－2次后，将沉淀加入到6％的BSA中沉降15－20分钟（纯化心肌细胞），然后计数，点板或培养。
此法中如果各步注意无菌操作，最后先用加倍双抗的培养基培养24h后，再换正常培养基，可适用于条件不是很好的试验室。
如果能在板或瓶内加入Laminin处理后，贴壁很好。
如果分离出来的心肌细胞，逐级复钙后培养，状态更好。
最佳状态此中方法能培养7天以上。