分子克隆及蛋白表达

三、克隆过程概述
（四）重组子的筛选
从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定 出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是 筛选。发展起来的成熟筛选方法如下： 1、插入失活法
外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活 ，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变 ，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。 常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落 是重组质粒）。
一、重要意义与应用
（二）在工业生产中的应用
分子克隆技术
基因 工程 细胞 工程
酶工 程
发酵 工程
紧密联系、综合利用
一、重要意义与应用
利用分子克隆技术生产的化学试剂：
丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙 烷、乌头酸和水杨酸等。
污水处理：
利用基因操作，将某种微生物的基因转入另一微 生物，创造对有害物质降解能力更强的新菌种，以 分解污水中的有毒物质。
1972年，斯坦福大学的 P.Berg 等人将一种猿 猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切 酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子相连 接，产生了一种新的重组DNA分子，奠定了基因克 隆技术的基础。
1973年， S.Cohen 等人把一段外源DNA片段与 质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该 重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立了基因 克隆体系。
一、重要意义与应用
（六） 在基因功能研究中的应用
1982年，《 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 》由Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，这部著作在20年中成为指导生命科学研 究的一部“圣经”。 分子生物学技术目前已经是几乎所有主流实验室 的必备技术，其中基因克隆技术作为基础和首要技 术，是大部分科研同行接触到的第一种分子生物学 技术。
三、克隆过程概述
基因组DNA较大，不利于克隆，需将其 处理成适合克隆的DNA小片段。 常用的方法：机械切割和核酸限制性内切酶消化 若基因序列已知且较小可直接合成。若基 因的两端部分序列已知，根据已知序列设计 引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技 术可以获得目的基因。
三、克隆过程概述
（二）载体的选择
分子克隆及蛋白表达 常见问题和对策
一、重要意义与应用
（一）重要意义 分子克隆技术起步于上世纪70年代 1、开辟了分子生物学研究的新领域； 2、打开了人类了解、识别、分离和改造基 因，创造新物种的大门； 3、对工业、农牧和医药业产生深远影响； 4、将为解决世界面临的能源、食品和环保 三大危机开拓新的出路。
根据载体的使用目的，载体可以分为克隆
载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。
源自文库
三、克隆过程概述
（三）体外重组
将目的片断和载体分子连接的过程。大多数 核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性 末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克 隆位点便可获得相同的黏性末端，通过T4 DNA连 接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。 当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平 端载体相连，此为平末端连接，连接效率差些。
一、重要意义与应用
基因过表达、RNAi、基因敲除、基因的定 点突变、CRISPR/Cas9等技术已在生命科学 研究中广泛应用，没有掌握分子克隆技术科 研将寸步难行。
二、基因克隆
（一）分子克隆技术的诞生
1972年11月，在檀香山有关质粒的会议上首次 出现基因克隆技术的想法。 Stanley Cohen （1986年诺奖获得者），对 Herbert W.Boyer 关于细菌酶切割DNA分子特定部 分的介绍很感兴趣。在威基基的一间熟食店里，两 位科学家相遇，构思出了一个开创现代生物技术产 业的实验。 1973年初，他们推出了一系列实验，以选择特定 的外源基因在细菌中复制。
三、克隆过程概述
4、 具有尽可能多的限制酶单一切点，为避 免外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更 大的选择范围。 若载体上的单一酶切位点是位于检测表型 的标记基因之内可造成插入效应，则更有利 于重组子的筛选。
三、克隆过程概述
DNA克隆常用的载体： 质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage） ，科斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载 体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid） 、酵母人工染色体（YAC）等。
三、克隆过程概述
将外源重组 DNA 分子导入原核宿主细胞的方法有 转化（transformation），转染（transfection）， 转导（transduction）。重组质粒通过转化技术可 以导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体DNA可以 通过转染技术导入。转染效率不高，因此将重组 噬菌体 DNA或柯斯质粒体外包装成有浸染性的噬 菌体颗粒，借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子 导入到宿主细胞转导技术，该 转导技术 的导入效 率要比转染的导入效率高。
二、基因克隆
（三）基因克隆的概念 基因克隆是70年代发展起来的一项具有 革命性的生物技术，最终目的在于通过相应 技术手段，将目的基因导入宿主细胞，在宿 主细胞内目的基因被大量的复制。
该技术可概括为∶分、切、连、转、选。
二、基因克隆
切：用序列特异的限制性内切酶切开载体 DNA，即切出目的基因； 连：用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA相 连接，形成重组DNA分子； 转：将重组DNA分子送入宿主细胞中进行复 制和扩增； 选：从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分 子的个体。
基因工程的载体的性质：
1、在宿主细胞中有独立复制和表达的能力，能使外 源重组的DNA片段得以扩增； 2、分子量尽可能小，在宿主细胞中有较多的拷贝， 便于结合更大的外源DNA片段，并在实验操作中不 易被机械剪切破坏； 3）最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗 药性标记基因），以赋予宿主细胞不同的表型（如 对抗生素的抗性）。
二、基因克隆
（二） 什么是基因
基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定 核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片 段。 基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种 的不同个体表现出不同的性状的根本原因。 "种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。 基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给 下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到 表达。
食品工业：
利用细菌可生产蛋白质、氨基酸和糖等。
一、重要意义与应用
（三） 在制药工业中应用 利用分子克隆和发酵技术已工业化生产 重组蛋白药物及相关产品：胰岛素、人牛 鸡的生长激素、人干扰素、松弛素、促红 细胞生长激素、乙肝病毒抗原和口蹄疫病 毒抗原等。 利用分子克隆技术还可提高微生物本身 所产生的蛋白和抗生素类药物的产量。
三、克隆过程概述
有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插 入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将 平端DNA分子通过一些修饰，如同聚物加尾，加 衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可 以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰 黏末端连接。
三、克隆过程概述
（四）导入受体细胞
载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复 制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中 复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩 增，最终获得大量同一的重组DNA分子。
二、基因克隆
（四）基因克隆的基本过程 基因克隆涉及一系列的分子生物学技术 ，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各 种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞 技术和重组子筛选技术等等。
三、克隆过程概述
（一）目的DNA片段的获得
基因克隆的第一步是获得包含目的基因在 内的一群DNA分子 。 DNA分子的来源： 1、目的生物基因组； 2、目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA 分子。
四、克隆的其它要素
设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。涉及到 dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲 基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲 基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化。有这两 种位点那么多数情况内切酶是切不开了。 容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生 就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个 C就会发生dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个 GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。设计引 物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不 了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基 化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以进行 酶切。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110 （invitrogen）、JM110等。
二、基因克隆
基因工程技术的两个最基本的特点： 1、分子水平上的操作 2、细胞水平上的表达 分子水平上的操作即是体外重组的过程， 是利用工具酶对DNA分子进行“外科手术"。 基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性 繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工 程等。
二、基因克隆
（三）最初的基因克隆实验
三、克隆过程概述
4、免疫学筛选法
获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用 免疫学筛选法获得目的基因克隆。
注意：上述方法获得的阳性克隆最后要进行 测序分析，以最终确认目的基因。
四、克隆的要素
（一）质粒
四、克隆的质粒要素
（一）特点： 环状DNA分子能够自我复制,或整合到染色 体上,随染色体复制.(最重要一点,可自我复 制)； 有多个限制酶切点(便于切割)； 有标记基因(便于进行检验和筛选)； 有可诱导的启动子(便于基因的诱导表达) 。
一、重要意义与应用
（五） 在农业生产中的应用 许多外源基因导入植物的研究获得成功。
培育新品种 、作物品质改良、促进作物增 产、防除杂草、防治病虫害、抗病菌 等。
影响植物基因工程在农业中应用的因素： 1、对人体的安全性问题 2、转基因DNA 在作物生长中转移或漂移至其他作物，从而 引发环境及生态问题 3、转基因作物在农产品贸易中的问题
四、克隆的质粒要素
质粒类型： 类型有天然质粒；人工构建质粒。按基因工 程构建方式可分为:插入失活型质粒 ；表达型 质粒； 按拷贝数可分为:高拷贝；低拷贝数质 粒
四、克隆的其它要素
（二）PCR引物的设计
用软件来设计，既要考虑发夹结构，又要考虑二聚体 ，还要考虑Tm值，显得特别复杂。 首先保证你要的基因是正确的，这个可以从NCBI中 找到，大部分是没问题； 然后再找到起始密码子，从那开始大概上游取2027bp，加上酶切位点，加上保护碱基（一般3个）就是上 游引物，取后20-27bp碱基，反向互补，加上酶切位点和 保护碱基组成下游引物。这样引物设计就完成了，再放到 软件里看看GC含量，Tm值，发夹结构，二聚体等，适当 调整碱基个数和保护碱基的个数。需要额外注意的是移码 问题。
一、重要意义与应用
（四） 在基因治疗中的应用 通过基因水平的操纵而治疗或预防疾病。 基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活
1990 年，NIH进行了世界上首例基因治疗临床试验
修复了一个复合免疫缺陷综合征女孩腺苷脱氨酶的活性， 使其免疫系统得到了恢复。
2012 年，首个基因治疗产品获批上市
欧洲药品管理局批准荷兰生物技术公司UniQure 以重组 腺相关病毒( AAV) 为载体的基因治疗药物Glybera上市，用于 脂蛋白脂酶缺乏症( LPLD) 患者的治疗。
三、克隆过程概述
2、PCR筛选和限制酶酶切法 提取转化子中的重组DNA分子作模板，根 据目的基因已知的两端序列设计特异引物 ，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛 选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法 进一步鉴定插入片段的大小。 注意： 菌落PCR技术筛选阳性克隆时，如果 克隆的基因本身来源于宿主的话，不能采 用该技术
三、克隆过程概述
3、核酸分子杂交法
制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂 交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因 特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片 段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一 群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。
注意： 该方法筛选阳性克隆时，如果克隆的 基因本身来源于宿主的话，不能采用该技 术