实验七 动物染色体标本的制备与观察

实验七动物染色体标本的制备与观察

实验目的

1．初步掌握动物骨髓染色体标本制备过程，了解操作步骤的原理。

2．了解常用实验动物染色体的数目及特点。

实验原理

染色体的分析往往是选择细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处理后细胞进入分裂的动物组织。在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。给动物注射一定剂量的秋水仙碱即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。在动物实验时，可在取材前经腹腔注射有丝分裂抑制剂，一般常用秋水仙素，这此方法对于动物的核型分析是非常有用的。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。因此骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。

实验用品

一、材料

无尾两栖类蛙属或蟾蜍属动物

二、器材

水平离心机、显微镜、刻度离心管（10ml）、注射器（1ml）、载玻片、烧杯（400ml）、量筒（100ml）、试管架、镊子、剪刀、解剖刀、吸管。

三、试剂

1．1%柠檬酸钠溶液：称取1g柠檬酸钠（柠檬酸三钠，Tri-sodium citrate, AR）溶解于100ml 蒸馏水中。

2．500μm/ml、100mg/ml秋水仙素溶液。

3．Giemsa（姬姆萨）原液（pH6.8）

Giemsa染粉1g

甘油（丙三醇，glycerine, AR）33ml

甲醇（methyl alcoholA, AR）45ml

将染粉倾入乳钵，加几滴甘油，在乳钵内研磨直到无颗粒为止，此时再将全部剩余甘油倒入，放入60～65℃保温箱中保温2h后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备用。

4．0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）

Na2HPO4·12H2O 11.81g

(或Na2HPO4·2H2O 5.92g)

KH2P04 4.5g

溶解于蒸馏水中至1000 ml。

5．1:10 Giemsa磷酸缓冲液（pH6.8）：取1ml 姬姆萨原液用9ml 0.067mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 6.8)稀释即可。当天临时配制，一天后失效。

6．甲醇7．冰醋酸8．0.4% KCl

实验方法

1. 动物按30μg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，3～4h后杀死动物．取出动物后肢的胫骨和股骨。剪去两端。

2．将1ml 1%柠檬酸钠用lml注射器接上5"针头注入骨髓腔．将骨髓细胞先冲入离心管，反复冲洗直至股骨变为灰白色，取下注射器针头（或用吸管），反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散成单个细胞。

3. 视骨髓量之多寡加入事先预热至26±0.5ºC的0.4%KCl溶液8ml．随即将离心管置26±0.5℃水溶中低渗20-30min。

4．以l 000r／min离心8min。

5. 弃上清液，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸(3：1)固定液5ml，加固定液时注

意不要冲动细胞团块。

6．加完固定液后，立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min。如此反复固定2～3次，每次20min。

7 固定的细胞经离心（l 000r／min离心8min。）后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。

8．在干净、湿、冷（最好低温处理一下，冰片容易使细胞固定）的载玻片上滴2-3滴上层细胞悬液，立即用口向同一方向吹，使细胞染色体分散，在酒精灯上文火烘干(在空气干燥的地方可不用，室温下晾干)。

9．将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加1: 10 Giemsa磷酸盐缓冲液3-4ml，染色10min。

10．在自来水管下细流冲洗数秒，去掉Giemsa磷酸盐缓冲液，用小块纱布擦干玻片标本底面和四周，显微镜观察和分析。

实验结果：在显微镜下可观察到染色体被Giemsa磷酸盐缓冲液染为紫红色。

作业：绘制染色体图。