原核表达之引物设计

引物设计原则
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构 11. 引物应具有特异性
常用引物设计软件
• • • • • • Premier Primer 5.0 Oligo 6.0 Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar
Premier Primer 5.0
主要功能: 1.自动搜索 2.引物设计 3.限制性内切酶位点分析 4.DNA 基元(motif)查找 5.同源性分析
Oligo 6.0
1.功能较Premier Primer 5.0更为单一，主要 是引物设计及引物评价 2.常与Premier Primer 5.0联合使用进行原核 表达所用引物的设计
打开Oligo 6.0
点击 “ｃｈａｎｇｅ” ＞＞＞＞ “Current oligo length Ｆ９”
点击“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞ “ＰＣＲ Ａｌｔ＋Ｐ”
点击“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞ “Ｆａｌｓｅ Ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅｓ”＞ “Ｕｐｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒ”
下拉滚动条，下一方块中的数值要求同上
原核表达引物设计实例分析
鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer） ompA
登录NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
共１１６４ｂｐ， 按照把各位数字相 加，除以３得整数， 即可认为这一序列 能编码完整的氨基 酸序列
鸭疫里氏杆菌 ompA序列
原核表达
之
引物设计
自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式 反应(PCR)以来,PCR技术已成为分子生物学 研究中使用最多、最广泛的手段之一,而引 物设计是PCR技术中至关重要的一环
引物设计原则
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计 2.引物长度一般在15~30碱基之间 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好 接近72℃ Tm= 4（G+C）+2（A+T） 4.引物3′端要避开密码子的第3位 5.引物3′端不能选择A，最好选择T 6. 碱基要随机分布
同样的操作查 看”False Priming Sites” 选项中“Lower Primer”的各项 数值是否合适
点击“Edit”>>>> “Upper Primer Alt+U” 和 “Lower Primer Alt+L”
引物信息保存方式
查找酶切位点
打开Primer Premier >> “File”>> “New”>> “New DNA Squence”
ATGGACAAGGAGTTTATGTTGATGACTGGTCTTGGTCTTCAGCTTAAATTTGCTGGTCTTCTTTTTGGAA ACGAAGATGCGTGGTTTGACCCTTATGTAAGAGTTGGAGCCAACTATTTGAGACACGACTATACAGGTCT TACGTTCCCTGTGACTGATAGCTACAATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGAAAATAAACCATACACT CAAGGAAGAGCGGATCATTTTGCTTTATCAACAGGTTTAGGTACAAACATTTGGTTAACTAAGAACTTTG GTCTTGGTATCCAAGGGGATTATGTTTCTACTCCAGTAGATAAGTCTGGATTGGCTAACTTTTGGCAAGC GTCAGCTTCATTGAACTTTAGATTTGGTAACAGAGATAAGGATAAGGATGGAGTGTTAGATAAAGACGAT TTATGTCCAGAAATACCAGGTTTACCTGAATTCCAAGGTTGTCCAGATACAGATGGCGATGGAGTTCCAG ATAAAGATGATAACTGTCCAGAAGTTGCAGGACCAGTTGAAAACAACGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGA CAAAGATGGTGTATTGGATAAAGACGATGCTTGTGTTGATGTAGCTGGACCTGCTGAAAACAATGGTTGT CCTTGGCCAGATACAGATAATGATGGAGTATTAGATAAAGATGATAAGTGTCCTAATGTTCCAGGTCTTC CAGAATACAAAGGTTGTCCTAAGCCTCAGGAAGCGTATGCAGTTGAAGCAACAGGAGCATTAAAGGGTAT ATTCTTCAACTTTAATAAAGCATCTATCAGACCTGAATCTAATACTAAGTTAGATCAAGCTGCTGAAGTG ATTAAGTCTTCTAACGGAGGTACTTTCTTAGTGGTAGGTCATACGGATGTTAAGGGTAATGCTAACTACA ACTTGAAACTTTCTAGAGAAAGAGCTGCATCTGTAGTAGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGAGTTAATCCATC TCAGTTAAAATCTAAAGGGGTTGGTTCTGCTGAAGCTACAGTACCAGCGTCTGCTTCTAACGAAGAGAGA ATGAAAGACAGAAAAGTGGTTGTAGAAGCAATCAGCGGATCTGCTTGGGAAGCTCTTCAAAAGTCTGATC TTCCAGTAGTGAAGAAAAAAGTAGTAAAAAAGAAAAGAAAATAA
Байду номын сангаас
将基因序列复制粘贴到EditSeq 软件内并保存
将DNA Sequence 翻译成氨基酸序列
Control+A 选中DNA Sequence,点击“Goodies”>>> “Translate DNA”
查看有无信号肽（Signal Peptide）
SignalP 3.0 Server :http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/