重组人白细胞介素-2

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3.易于纯化： 在重组白细胞介素2的纯化过程中，白细胞介素2要被还原 剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素2 。由 于125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫 键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异 构体和二聚体一方面会给纯化工作带来麻烦，另一方面比活性 降低。125位cyt被ser或Ala取代的IL-2则不纯在错配问题，因而 有利于IL-2的纯化。
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基因工程制备流程
T细胞mRNA
反转录
cDNA IL-2 cDNA 文库的构建 利用探针杂交筛选
IL-2 cDNA阳性克隆
与质粒载体pBV220连接， 并转入大肠杆菌DH5a
IL-2基因表达
分离纯化包涵体 溶解，复性，纯化 纯化的rIL-2
制备方法： 1.构建工程菌：将载有IL-2基因的质粒导入大肠杆菌细胞中，筛 选出目的菌。 2.挑单菌落接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30 ℃振荡培养810小时，然后转入含有合成培养基的发酵罐中，30 ℃下培养 11-13小时，再在42 ℃下培养5-6小时，发酵后收集菌体。 3.包涵体提取：取菌体，用PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl1mMol EDTA-1mMol DTT缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同样缓冲 液中，加溶菌酶，4 ℃下作用30分钟，冰浴超声至完全破裂为 止，离心除去可溶性杂志，沉淀悬于PH8.5浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-2mMol DTT。搅拌下缓慢滴加同体积 PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-8mMol 尿素，室 温下缓慢搅拌20-40分钟，离心除去可溶性杂志，沉淀再用缓 冲液洗两遍，再将沉淀溶于PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl10mMol DTT-7至8Mol GuHCL,溶解1.5小时后离心取上清在4 ℃ 保存。
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4.（1）凝胶层析：取上清装入sephacrylus-200中，用 PH8.5，浓度为 50mMol Tris.Hcl-3至6Mol GuHcl充分平衡后上样，平衡液洗脱，结果出现三个蛋 白峰，收集第三峰，4 ℃保存； （2）复性：取凝胶层析后样品，浓度为50mMol Tris.Hcl稀释三倍，加氧化和还原性谷胱甘肽，至 1mMol和5-10mMol，调PH使为7-9，室温放置两小时，浓 缩至10倍，过sephadex G25柱，用PH3.0，浓度为 0.1molGlyHcl平衡并洗脱，收蛋白峰。 （3）高效液相层析：用HPLC仪进行纯化，用0.1%三氟 乙酸平衡Cl反相柱后 ，泵入rIL-2样品，进行乙啨梯度 洗脱，收集活性峰，低温减压下快速去除乙啨，即可得 到rIL-2纯品。
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4.降低毒性： 125位cyt被ser或Ala取代的IL-2由于比活性进一步提高，在 给予同等活性的IL-2时，新型IL-2由于蛋白质的绝对数量较少而 可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，从而有利于临床治 疗的进行。
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化学修饰：
对蛋白进行化学修饰后可以提高其抗酶消化的能力, 延 长其在体内的作用时间, 提高药效，降低或消除其在体内 的免疫原性。对IL-2 进行修饰的主要为PEG,。 1992 年有人利用N-羟基丁二酰胺活化PEG 修饰r IL-2, 作用时间提高10 倍，而且免疫原性下降, 抗肿瘤性能提高, 毒副作用有所降低。 1994 年和1997 年及其后都有人用PEG 修饰rIL-2 得到 生物活性基本不变而抗原性降低的修饰蛋白的报道; 随后白 介素-2 的化学修饰研究与其它蛋白的化学修饰一样成为了 研究的热点。
1. 肿瘤治疗： 在恶性肿瘤的发病机制中, 肿瘤病人的白 介素-2 含量较正常的水平低, 不能使NK、 CT L、LAK 等杀伤细胞活化和增殖, 使肿瘤 细胞逃逸，得不到清除。此时必须提供外 源白介素-2, 帮助病人完成免疫监视功能, 这 就是白介素-2 治疗肿瘤的免疫学基础。
2.抗病毒感染 3.对感染性疾病的治疗作用 4.对其他疾病的治疗：白介素-2 在急性白血 病、抗高血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面 都有着积极的应用。
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二、生产制备
生产制备的方式主要有两种： 1、传统工艺制备 2、基因工程制备 其中以第二种方法为主
传统工艺流程
IL-2为螺旋状的长肽链，由 133个氨基酸组成，其中共 有三个半胱氨酸（cys)分别 在第58、105、125位，其中 58位与105位的cys生成的二 硫键为活性所必需，且易错 配或生成二聚体，降低生物 活性。
IL-2
基因工程重组IL-2用点 突变的方法把125位的 cys改成Ser或Ala，使 IL-2分子稳定性增强。 如果用点突变的方法 把58或105位的cys变成 其他氨基酸，则rIL-2 的活性几乎完全丧失。
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一 级 结 构
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改造后的优点
1.提高白细胞介素2的比活性 2.提高白细胞介素2的稳定性： 由于野生型白细胞介素2分子中125位cyt是游离的，易 于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二 硫键而导致二聚体的形成，不利于白细胞介素2的稳定。 125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配问题。
免疫作用机理
IL -2 能与任何能形成IL -2 受体的细胞, 如辅 助性T 细胞(T H ) 、细胞毒性T 细胞(T e ) 、 B 细胞和自然杀伤细胞结合, 但结合的强度 以T c 细胞为最高。 IL -2 与相应受体结合后, 细胞即从G 相进入S 相并开始分化增殖。
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临床应用
重组人白细胞介ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ-2
Recombinant Human Interleukin-2
白细胞介素-2基本信息

为多肽类免疫增强剂，是一种淋巴因子。 刺激B细胞增殖分化和分泌抗体。 诱导干扰素和多种细胞因子的分泌 用于肿瘤辅助治疗和癌性胸、腹水的治疗。 也可各种自身免疫病的治疗。 对乙型肝炎、麻风病、肺结核、白色念珠菌感染 等具有一定的治疗作用。