第四章核酸操作基本技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂 解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAC或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质 及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；
上清液中的DNA用酚/氯仿抽提（变形蛋白质），反复抽提后 用乙醇沉淀水相中的DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
www.themegallery.com
第二部分 DNA提取常见问题、原因分析及其对策
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
DNA提取 的基本步骤
III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
www.themegallery.com
材料准备
基因组DNA的提取
2.
3.
对 策
4.
5.
6.
尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相 应的缓冲体系；
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作 要轻柔；
离心分离两相时，应保证一定的转速和时间； 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的 去杂质的方法；
www.themegallery.com
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法
非基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
其它
• 碱裂解法 • 煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
• 差速离心结合SDS裂解法
www.themegallery.com
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
www.themegallery.com
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
1.
2.
重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂质 （具体方法见前）
重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次 数（2-3次）
www.themegallery.com
对 策
2.
3.
3.
问题二：DNA降解。
原 因
1.
1.
2.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
• • •
阴离子交换树脂
适用于纯度要求高的实验。 特点：高纯度 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的
磁珠
物，从而达到分离目的。
特点：低成本
www.themegallery.com
基因组DNA－其它方法
浓盐法（生化试验做过）：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
第四章 核酸操作基本技术
第一节 核酸的提取与纯化
第二节 核酸的检测与保存
第三节 核酸凝胶电泳 第四节 核酸分子杂交
www.themegallery.com
第一节 核酸的提取与纯化
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA(乙二胺四乙酸 )螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP(脱氧核糖核蛋白 )充分溶解，存在于
液相中；
CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三
甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核 酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（> 0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有
机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即 可使核酸分离出来。
变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀， 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而 可通过离心将两者分开。
www.themegallery.com
碱裂解法流程图
菌体 上清液 沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶液
溶液III中和
离心洗涤
易去除；
www.themegallery.com
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl （pH8.0） 100 mM EDTA （pH8.0） 20 mM
组份 终浓度
NaCl 1.4M
CTAB 3%(W/V)
PVP40 5%(W/V)
β-巯基乙醇 2%（V/V）使 用前加入
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一
最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失
尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量
www.themegallery.com
核酸沉淀、溶解
基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
www.themegallery.com
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信
息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核
酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基
本的操作 。
如何快速、高效的提取高质量的核酸是基因工 程成功与否的第一步！！！
www.themegallery.com
第一部分：DNA提取方法简介
www.themegallery.com
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线 状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成 沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在 液相中，从而可通过离心将两者分开。
质粒DNA的提取
菌体量适当 培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮 变性的时间不要过长（5分钟）， 否则质粒易被打断
• • • • •
复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染
G＋菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁
www.themegallery.com
核酸分离、纯化
组份 终浓度 Tris-HCl pH8.0） 10 mM EDTA （pH 8.0 ） 20 mM NaCl 0.4M SDS 2%
www.themegallery.com
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
www.themegallery.com
www.themegallery.com
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一 定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分 级分离出来。
差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离 心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以 分离。
盐离子的去除：
用多糖水解酶将多糖降解。 70％的乙醇洗涤 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的 羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
www.themegallery.com
第三部分：RNA提取方法简介
RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法
原理：
• 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白
体上的蛋白变性，核酸释放；
种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染
；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
www.themegallery.com
CTAB法流程图
植物材料 裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
www.themegຫໍສະໝຸດ Baidullery.com
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
www.themegallery.com
问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 2. 3. 4.
1.
2.
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分
沉淀不完全
洗涤时DNA丢失
对 策
3.
4. 5. 6.
尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
www.themegallery.com
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度 Tris-HCl （pH 8.0） 100 mM EDTA （pH 8.0） 20 mM NaCl 1.4M CTAB 2%(W/V) β-巯基乙醇 0.1 %（V/V） 使用前加入
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法
www.themegallery.com
根据核酸分离纯化方式的不同有：
吸附材料结合法：
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 特点：快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
www.themegallery.com
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
蛋白质的去除：
酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤
杂质的去除
多酚的去除：
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙 醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等
蛋白酶处理
多糖的去除： 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙
二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M 类与DNA的结合 NaCl，高盐可溶解多糖。
菌株不要频繁转接（质粒丢失）
含病毒的液体材料DNA含量 较少，提取前先富集
www.themegallery.com
细胞裂解 基因组DNA的提取
材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡
上清液中的DNA用酚/氯仿抽提（变形蛋白质），反复抽提后 用乙醇沉淀水相中的DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
www.themegallery.com
第二部分 DNA提取常见问题、原因分析及其对策
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
DNA提取 的基本步骤
III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
www.themegallery.com
材料准备
基因组DNA的提取
2.
3.
对 策
4.
5.
6.
尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相 应的缓冲体系；
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作 要轻柔；
离心分离两相时，应保证一定的转速和时间； 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的 去杂质的方法；
www.themegallery.com
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法
非基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
其它
• 碱裂解法 • 煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
• 差速离心结合SDS裂解法
www.themegallery.com
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
www.themegallery.com
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
1.
2.
重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂质 （具体方法见前）
重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次 数（2-3次）
www.themegallery.com
对 策
2.
3.
3.
问题二：DNA降解。
原 因
1.
1.
2.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
• • •
阴离子交换树脂
适用于纯度要求高的实验。 特点：高纯度 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的
磁珠
物，从而达到分离目的。
特点：低成本
www.themegallery.com
基因组DNA－其它方法
浓盐法（生化试验做过）：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
第四章 核酸操作基本技术
第一节 核酸的提取与纯化
第二节 核酸的检测与保存
第三节 核酸凝胶电泳 第四节 核酸分子杂交
www.themegallery.com
第一节 核酸的提取与纯化
第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策 第三部分：RNA提取方法简介 第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA(乙二胺四乙酸 )螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP(脱氧核糖核蛋白 )充分溶解，存在于
液相中；
CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三
甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核 酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（> 0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有
机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即 可使核酸分离出来。
变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀， 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而 可通过离心将两者分开。
www.themegallery.com
碱裂解法流程图
菌体 上清液 沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶液
溶液III中和
离心洗涤
易去除；
www.themegallery.com
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl （pH8.0） 100 mM EDTA （pH8.0） 20 mM
组份 终浓度
NaCl 1.4M
CTAB 3%(W/V)
PVP40 5%(W/V)
β-巯基乙醇 2%（V/V）使 用前加入
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一
最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
质粒DNA的提取
使用处于对数期的新鲜菌体 （老化菌体导致开环质粒增加）
培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失
尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量
www.themegallery.com
核酸沉淀、溶解
基因组DNA的提取 质粒DNA的提取
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
www.themegallery.com
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信
息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核
酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基
本的操作 。
如何快速、高效的提取高质量的核酸是基因工 程成功与否的第一步！！！
www.themegallery.com
第一部分：DNA提取方法简介
www.themegallery.com
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线 状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成 沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在 液相中，从而可通过离心将两者分开。
质粒DNA的提取
菌体量适当 培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮 变性的时间不要过长（5分钟）， 否则质粒易被打断
• • • • •
复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染
G＋菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁
www.themegallery.com
核酸分离、纯化
组份 终浓度 Tris-HCl pH8.0） 10 mM EDTA （pH 8.0 ） 20 mM NaCl 0.4M SDS 2%
www.themegallery.com
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
www.themegallery.com
www.themegallery.com
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一 定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分 级分离出来。
差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离 心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以 分离。
盐离子的去除：
用多糖水解酶将多糖降解。 70％的乙醇洗涤 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的 羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
www.themegallery.com
第三部分：RNA提取方法简介
RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法
原理：
• 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白
体上的蛋白变性，核酸释放；
种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染
；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
www.themegallery.com
CTAB法流程图
植物材料 裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
www.themegຫໍສະໝຸດ Baidullery.com
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
www.themegallery.com
问题三：DNA提取量少。
原 因
1. 2. 3. 4.
1.
2.
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分
沉淀不完全
洗涤时DNA丢失
对 策
3.
4. 5. 6.
尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
www.themegallery.com
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度 Tris-HCl （pH 8.0） 100 mM EDTA （pH 8.0） 20 mM NaCl 1.4M CTAB 2%(W/V) β-巯基乙醇 0.1 %（V/V） 使用前加入
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法
www.themegallery.com
根据核酸分离纯化方式的不同有：
吸附材料结合法：
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 特点：快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
www.themegallery.com
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
蛋白质的去除：
酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤
杂质的去除
多酚的去除：
在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙 醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等
蛋白酶处理
多糖的去除： 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙
二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M 类与DNA的结合 NaCl，高盐可溶解多糖。
菌株不要频繁转接（质粒丢失）
含病毒的液体材料DNA含量 较少，提取前先富集
www.themegallery.com
细胞裂解 基因组DNA的提取
材料应适量，过多会影响裂解， 导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡