临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
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过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过 滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰 作用。
肝素的作用机理
每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制 酶活性。 在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNase 25 ℃2小时) 可去除肝素的抑制作用。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
核酸纯化
核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年 代，在七十年代和八十年代中传统的核酸 沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用 和推广。
传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、 蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等 步骤。
一般核酸提取试剂促使靶核酸 从细胞内释出的原理
靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞 浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病 原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫 或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸 亦可存在于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞， 用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核 酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出 来。
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清 加入裂解液50ul，60℃温育30min 90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物 取5ul用于PCR检测
痰标本处理的基本模式
通用模式
简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)
临床标本的滤纸上保存
临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸 为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为 RNA，则可稳定数周。 保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为 标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球 蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测 造成影响。 不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、 分泌物等均可此种方法。
血红蛋白、乳铁蛋白
血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的 主要PCR抑制物,它们均含有铁。抑制机制可能是：
（1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。
研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而
且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等
血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。
（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性
如何避免 RNase 对标本的污染及防止 RNase 对 提 取 的 RNA 的 降 解 , 是 保 证 RNA成功提取的关键之所在。
RNA提取所用器皿的处理
经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管 , 离心管等基 本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA. 实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于 180℃干烤 8小时以上 , 或用 0.1% 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 的水 溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下 放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分 钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量 的 DEPC, 以防 DEPC 通过羧甲基化作用对 RNA 的嘌呤碱基 进行修饰。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊
液,尿液等,可按水样标本的方式离 心取沉淀后 , 提取核酸。沉淀样本 的保存同上。
乳汁
乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏 菌等的PCR检测。
乳汁中分枝杆菌DNA的提取
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
去除或减轻抑制的一些方法wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可 降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应， 既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功 扩增，而通常血液含量只能是0.2%。 BSA也可增加Taq DNA聚合酶的扩增能力， 使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能 力分别提高10和20倍。 单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类 似BSA的增强效应。
痰
痰属于分泌物 , 临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定 标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用 1 mol/L NaOH 或变 性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取 , 可保存于 -70℃ 下。
核酸的分离纯化
核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类 等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验 室在使用前，必须对其核酸提取纯度 和效率进行评价。
DNA提取的经典方法
即所谓的”
酚-氯仿提 取法”
RNA提取的独特性
临床标本及实验室环境中 , 存在大量对 RNA 具有强烈降解作用的 RNase ，而 RNase较耐高温,不易失活。
临床标本中PCR反应抑制物
内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及 其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红 蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、 多糖等。
外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤 维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石 粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。
肝素的作用机理
肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强 的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核 酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和 RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
70%乙醇洗涤沉淀，干燥 50ul Tris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR扩增
组织
组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首 先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水 后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取 核酸。 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理 盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生 理盐水,然后 , 边摇边加入无水乙醇至终浓度为 50%. 这样固 定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取 ,需先用辛烷或二甲苯脱蜡 ,再用蛋 白酶K消化后即可进行DNA提取。
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 , 充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液 , 裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸 , 可保存 于-70℃下.
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过 滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰 作用。
肝素的作用机理
每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制 酶活性。 在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNase 25 ℃2小时) 可去除肝素的抑制作用。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
核酸纯化
核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年 代，在七十年代和八十年代中传统的核酸 沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用 和推广。
传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、 蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等 步骤。
一般核酸提取试剂促使靶核酸 从细胞内释出的原理
靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞 浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病 原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫 或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸 亦可存在于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞， 用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核 酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出 来。
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清 加入裂解液50ul，60℃温育30min 90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物 取5ul用于PCR检测
痰标本处理的基本模式
通用模式
简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)
临床标本的滤纸上保存
临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸 为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为 RNA，则可稳定数周。 保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为 标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球 蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测 造成影响。 不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、 分泌物等均可此种方法。
血红蛋白、乳铁蛋白
血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的 主要PCR抑制物,它们均含有铁。抑制机制可能是：
（1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。
研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而
且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等
血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。
（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性
如何避免 RNase 对标本的污染及防止 RNase 对 提 取 的 RNA 的 降 解 , 是 保 证 RNA成功提取的关键之所在。
RNA提取所用器皿的处理
经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管 , 离心管等基 本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA. 实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于 180℃干烤 8小时以上 , 或用 0.1% 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 的水 溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下 放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分 钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量 的 DEPC, 以防 DEPC 通过羧甲基化作用对 RNA 的嘌呤碱基 进行修饰。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊
液,尿液等,可按水样标本的方式离 心取沉淀后 , 提取核酸。沉淀样本 的保存同上。
乳汁
乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏 菌等的PCR检测。
乳汁中分枝杆菌DNA的提取
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
去除或减轻抑制的一些方法wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可 降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应， 既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功 扩增，而通常血液含量只能是0.2%。 BSA也可增加Taq DNA聚合酶的扩增能力， 使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能 力分别提高10和20倍。 单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类 似BSA的增强效应。
痰
痰属于分泌物 , 临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定 标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用 1 mol/L NaOH 或变 性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取 , 可保存于 -70℃ 下。
核酸的分离纯化
核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类 等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验 室在使用前，必须对其核酸提取纯度 和效率进行评价。
DNA提取的经典方法
即所谓的”
酚-氯仿提 取法”
RNA提取的独特性
临床标本及实验室环境中 , 存在大量对 RNA 具有强烈降解作用的 RNase ，而 RNase较耐高温,不易失活。
临床标本中PCR反应抑制物
内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及 其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红 蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、 多糖等。
外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤 维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石 粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。
肝素的作用机理
肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强 的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核 酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和 RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
70%乙醇洗涤沉淀，干燥 50ul Tris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR扩增
组织
组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首 先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水 后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取 核酸。 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理 盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生 理盐水,然后 , 边摇边加入无水乙醇至终浓度为 50%. 这样固 定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取 ,需先用辛烷或二甲苯脱蜡 ,再用蛋 白酶K消化后即可进行DNA提取。
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 , 充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液 , 裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸 , 可保存 于-70℃下.