临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法

核酸纯化

核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年 代，在七十年代和八十年代中传统的核酸 沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用 和推广。
传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、 蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等 步骤。

一般核酸提取试剂促使靶核酸 从细胞内释出的原理


靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞 浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病 原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫 或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸 亦可存在于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞， 用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核 酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出 来。
70%乙醇洗涤沉淀，干燥 50ul Tris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR扩增
组织

组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首 先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水 后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取 核酸。 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理 盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生 理盐水,然后 , 边摇边加入无水乙醇至终浓度为 50%. 这样固 定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取 ,需先用辛烷或二甲苯脱蜡 ,再用蛋 白酶K消化后即可进行DNA提取。
临床标本中PCR反应抑制物

内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及 其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红 蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、 多糖等。
外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤 维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石 粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。

肝素的作用机理

肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强 的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核 酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和 RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率


1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
去除或减轻抑制的一些方法



加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可 降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应， 既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功 扩增，而通常血液含量只能是0.2%。 BSA也可增加Taq DNA聚合酶的扩增能力， 使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能 力分别提高10和20倍。 单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类 似BSA的增强效应。


临床标本的滤纸上保存



临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸 为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为 RNA，则可稳定数周。 保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为 标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球 蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测 造成影响。 不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、 分泌物等均可此种方法。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性

质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一

核酸提取的重要性

核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否


临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集

标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
痰标本处理的基本模式
通用模式
简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)
核酸的分离纯化
核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类 等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验 室在使用前，必须对其核酸提取纯度 和效率进行评价。

DNA提取的经典方法
即所谓的”
酚-氯仿提 取法”
RNA提取的独特性

临床标本及实验室环境中 , 存在大量对 RNA 具有强烈降解作用的 RNase ，而 RNase较耐高温,不易失活。
痰




痰属于分泌物 , 临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定 标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用 1 mol/L NaOH 或变 性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取 , 可保存于 -70℃ 下。

血红蛋白、乳铁蛋白

血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的 主要PCR抑制物,它们均含有铁。抑制机制可能是：
（1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。
研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而
且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等
血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。
（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性


沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊
液,尿液等,可按水样标本的方式离 心取沉淀后 , 提取核酸。沉淀样本 的保存同上。
乳汁

乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏 菌等的PCR检测。
乳汁中分枝杆菌DNA的提取
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.

脓液

脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 , 充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。

试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）


采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min



血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）

DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
标本运送


样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过 滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰 作用。

肝素的作用机理

每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制 酶活性。 在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNase 25 ℃2小时) 可去除肝素的抑制作用。
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式

试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清 加入裂解液50ul，60℃温育30min 90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物 取5ul用于PCR检测
IgG
Байду номын сангаасgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
全血


以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞


外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液 , 裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸 , 可保存 于-70℃下.
痰标本处理中要注意的问题


痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
如何避免 RNase 对标本的污染及防止 RNase 对 提 取 的 RNA 的 降 解 , 是 保 证 RNA成功提取的关键之所在。

RNA提取所用器皿的处理

经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管 , 离心管等基 本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA. 实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于 180℃干烤 8小时以上 , 或用 0.1% 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 的水 溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下 放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分 钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量 的 DEPC, 以防 DEPC 通过羧甲基化作用对 RNA 的嘌呤碱基 进行修饰。