第14章.同位素标记技术在分子生物学实验技术中的应用

成像观测
• 闪烁光纤屏 由塑料光纤制成的板，光纤中填有铅 和发光染料，使射线能转换为可见光光子， 然后再由电荷耦合器件CCD摄像机成像。较 胶片和磷光屏的分辨率好，近实时成像且 需曝光量低。
成像观测
• 放射性薄层扫描仪 由空间位置灵敏探测器组成核探测仪器。 可用于薄层层析板、凝胶电泳转印膜上放 射性条带的直接定位测定。
狭槽(slot)
菌落 噬菌 真核
原位杂交
液相杂交
Southern杂交
DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜 或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA 或RNA。 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA 片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤: (1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位 变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼 龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性 结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
• 掺入DNA探针的常用单体标 记化合物 [-32p]dATP，[32p]dCTP ， [-32p]UTP ，[32p]ATP 。
国内供应商：北京福瑞 国外供应商： UK
标记单体
• 在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标 记物主要是放射性同位素，如32P，33P和 35S 。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三 磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因 此使用 α 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸， 如 [ α- 32 P]dATP 。而在标记 5' 末端磷酸 基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的 ATP 。放射性的信号通过X- 光片放射自显 影或磷屏扫描获取。
核酸探针标记法 1.双链DNA探针
⑴ 切口平移法 首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后 借助于E.coli DNA聚合酶I的5`→3`外切酶活性，切去 带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活 性，使同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活 性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷 酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯 化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。最合适的 切口平移片段一般为50-500个核苷酸,产生均匀标记的 探针。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比 活性取决于[α -32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置 换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的 质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物 如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
12.33a 14.26d 25.5d 87.23d 60d 8.04的
衰变方 式
-(100) -(100) -(100) -(100) EC -(100)
粒子能量 /MeV
0.0186 1.709 0.248 0.167
粒子能量 /MeV
0.027-0.032
0.605 0.333
ห้องสมุดไป่ตู้
标记单体
核酸探针 RNA探针
DNA探针
单链DNA探针
cDNA探针
标记类别
标记信号 放射性标记
非放射性标记
32P，33P，3H, 35S，125I，131I
生物素、酶、地 高辛配体、荧光 素 等。
标记位置 均匀标记 非均匀标记 如DNA末端标记
标记核素
核素
3H 32P 33P 35S 125I 131I
半衰期
切口平移法
(2)随机引物法 通过热变性使模板DNA 变为单链DNA，随机 引物与单链DNA退火后，利用Klenow Fragment合 成互补链。此时如果底物中dNTP的一种或几种被 [α -32P], [α -35S], [3H] 等标记时，那么合成 的互补链DNA也被标记。合成后的双链DNA通过热 变性变成单链后即可用作杂交探针。
5.末端标记
（1）一种是在5`末端加成标记法：
先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 转移加到DNA片段5`-OH上。 （2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个 单标记的ddUTP。
6.PCR 扩增标记
在PCR扩增时加入标记的 dNTP ，不 仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩 增，尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形。
检测灵敏 Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与 32 P标记的高比活性探针的(>109 cpm/μ g)互补 DNA。如果将10μ g基因组DNA转移到滤膜上，并 与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则 可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序 列。
限制性酶切割
限制片段 琼脂糖电泳
瑞士卡玛
产地：德国
同位素薄层扫描仪
技术参数扫描面积为 400×200 mm（Gita , Rita ） 50×200mm(mini Gita ,mini Rita ) 扫描速度：可选 轨道数目：1-80 检测器：γ -radiation (BGO detector) ，ß-radiation (GM counting tube)，gasflow 检测能量范围：0-2000KeV 可检测的放射物: γ -radiation (BGO scintillation probe) 背景: 129I:0.7 cps (20-100 KeV) 灵敏度: 129I : 20 Bq in 10 min 分辨率: 129I : 2-3 mm(depending on the used collimator) 可检测的放射物: ß-radiation open proportional counting tube (Recommended for 3H -requires counting gas P10 = 90% Ar 10% Ch4) 背景: 18F : 0.1 cps 灵敏度: 18F : 10 Bq in 10 min 分辨率: 18F : 1-2 mm
反应后纯化
模板量要求
需要除去未反应的
dNTP ≥1 μg
不需要除去未反应的dNTP
≥25 ng
2.单链DNA探针
⑴ 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感 染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为 双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染 新的宿主菌。 将模板序列克隆到M13噬菌体,以特定的同用 引物或人工合成寡合苷酸为引物，在[-32P]dNTP 存在下，由Klenow片断 酶促合成标记探针，反应 完毕后，酶切长短不一的产物，然后通过变性凝 胶电泳与模板分离。
随机引物 法
• DNA标记法比较：
切口平移法 反应时间 延长反应时间会降低 标记效率。必须确保 反应时间。 ～108 dpm/μg 琼脂糖等抑制反应。 随机引物法 短时间内即可得到高比活性的 探针。即使反应时间延长也不 受影响。 ～109 dpm/μg 即使有琼脂糖等混入，也相对 不受影响。
探针比活性 模板纯度
X光自显影暗盒及图像增强屏
成像观测
储存磷光屏（storage phosphor screen） 一种由磷光晶体制成的影像屏（Imaging Plate)。经射线爆光后IP以潜能储存射线能，当 在读取装置下扫描读取时， IP在扫描激光下释放 潜能发出蓝绿光，光强与爆光时射线强度成正比， 用光电传感器转换电信号，再经模数转换成二进 制编码信号，由计算机成象系统合成为影象图。 操作：用塑料薄膜盖电泳凝胶，贴附于装于暗盒 的磷光屏曝光，然后在成像仪上，通过扫描磷光 屏上储存的光能进行成象。
美国的Bioscan公司 AR-2000图 像扫描仪
AR2000图像扫描仪可对所有类型同位素（包括3H）标 记的TLC板、凝胶、印迹进行直接定位定量计数测量。 扫描仪采用充气式计数器，可检测γ和β射线的同位素。 对整块薄层层析条带的扫描可在1分钟内完成。整套系 统包括一个仪器控制和数据采集软件，扫描结果以层析 图或2D图像显示，自动完成对峰的定量，并以多种方 式显示结果。 · 应用于TLC板、凝胶和印迹 · 不需破坏TLC板即可进行定量 · 对所有类型同位素（包括3H）灵敏 · 简单易用的WinScan软件 · 快速、自动、可靠的运行 · 提供出色的空间分辨率 · 针对1、2、3块TLC板可选择不同的型号 · 2-D彩色图像 · 主要应用于放射化学纯度、脂类生物化学、代谢研究、 酶分析、毒理学研究等领域。
UVI化学发光凝胶成像系统
与著名的Molecular DynamicsTM PhosphorImagerTM 系统是一样， 台风储磷技术---磷屏Typhoon9000系列能对所有电离辐射源提供高分 辨率图像并精确定量： 3H 32P 14C 33P 125I 35S 18F 99mTc大成像面积，高分辩光学系统和灵 敏的磷屏组合，为您提供可靠的实验结果。下图给出的是用32P标记的 AtlasTM 微阵列(macroarray)在GP屏上的图像。
⑵ 从RNA合成单链cDNA探针 用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: a. 寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用 于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏 向于mRNA 3‘末端序列。 b. 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上 述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA 中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列 往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到 的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可 被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析 即可得到单链探针。
3.寡核苷酸探针 若只知道待分离的目的基因编码的 蛋白质产物，而对其核苷酸序列一无所知， 即可设计合成寡核苷酸探针。 利用寡核 苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的 点突变。 单一已知序列的寡核苷酸探针. 种类 许多兼并性寡核苷酸探针组成的 寡核苷酸探针库.
4.RNA探针
许多载体如pBluescript, pGEM等均带有来自 噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们 能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA 聚合酶所识别,合成特异性的RNA。在反应体系中 若加入经标记的dNTP，则可合成RNA探针。 RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的 优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主 要是： RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的 稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性 的DNA探针所产生信号要强。 RNA:RNA杂交体用 RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA杂交体容易控制,所 以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果。
第14章.同位素标记技术在分子 生物学实验中的应用
中国农业大学 齐孟文
标记探针
• 探针（proble) 带有检测标记的，与被检测目标 物分子具有特异性互补反应性能的探测物分子或 分子片断。 • 探针类别
核酸探针 DNA、RNA
探针
非核酸探针，抗体、蛋白质分子标签等
核酸探针
双链DNA探针
DNA探针
标记一般流程
核酸分子杂交
• 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配 对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过 程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可 以根据所使用的探针已知序列进行特异性 的靶序列检测。
杂交类型
核酸杂交 固相杂交 印迹杂交
Southern Northern 斑点(dot)
虹吸印迹
杂交过程
分子杂交炉
成像观测
• 放射性自显影 利用标记核素自身的放射性射线 使感光材料感光成象的过程。目前常用的方法有: 传统的胶片自显影 感光屏：医用X光片；原理： 爆光过程，射线粒子使X光片乳胶基质中均匀分布 的溴化银晶粒感光形成物点的潜影，然后经显影 及定影得像图。胶片影象可在底片上直接观察。
DNA分子
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶 滤膜
转膜 吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
凝胶电泳
电泳示意图
转印方法
(1)毛细管虹吸 优点是简单,不需要用其他仪器。缺点 是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。 (2)电泳转印 将DNA变性后,经电泳印移至带电荷的尼 龙膜上。优点是可直接转移较大的DNA片段，缺点是转 移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管和真 空转移无效时,才予以采用。 (3) 真空转移 一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在 真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从 上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉 积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正 常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地 转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强23倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 在洗膜不严格 时,其背景比毛细管法的要高。