谷草转氨酶活性测定

谷草转氨酶活性测定

实验原理：

酮戊二酸反应起催化作用,在一定的反应条件下,产生一定量的草酰乙酸,草酰乙酸随之脱羧成为丙酮酸(Pyruvic acid ,简写Pyr) 。反应至规定时间后,加入 2 ,4 - 二硝基苯肼及盐酸溶液终止反应,同时2 ,4 - 二硝基苯肼与酮酸中羰基加成,生成丙酮酸苯腙。在碱性条件下,苯腙呈红棕色,其颜色深浅与丙酮酸含量在一定范围内成正比,可用分光光度计以500nm 波长进行比色,测定丙酮酸含量以确定GOT活度。

主要试剂

（1）0. 05mol/ L Tris - HCL 缓冲液(pH7. 2) :0. 2mol/ L 三羟甲基氨基甲烷(24. 2g 三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200ml) 50ml 和0. 2mol/ LHCl44. 2ml ,用蒸馏水稀释至200ml。

(2) 0. 1mol/ L 磷酸盐缓冲液:称取磷酸氢二钠(AR) 11. 928g ,磷酸二氢钾(AR) 2. 176g ,加

少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。

(3) 2 ,4 - 二硝基苯肼溶液:称取2 ,4 - 二硝基苯肼19. 8mg ,用10mol/ L HCL10ml 溶

解后,加蒸馏水至100ml ,保存于棕色瓶中备用,此液可保存 3 个月。

(4) 0. 4mol/ L 氢氧化钠溶液:16g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。

(5) 1mol/ L 氢氧化钠溶液:40g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。

(6)丙酮酸标准液(2 μmol/ ml) :精确称取纯丙酮酸钠22. 0mg于100ml 容量瓶中,加0.

1mol/ L 磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。

(7) GOT底物液(DL –天冬氨酸200mmol/ L , α-酮戊二酸2mmol/ L) :称取α- 酮戊二

酸29. 2mg和DL- 门冬氨酸 2. 66g置于一小烧杯中,加入1mol/ L 氢氧化钠20. 5ml 使溶解,并校正pH至7. 4 ,然后将溶液移入100ml 容量瓶内,用0. 1mol/ L 磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。

实验方法：

1酶粗制剂的提取将新鲜植物材料剪碎,取鲜重0. 2g左右放入研钵,加0. 05mol/ L Tris - HCl 缓冲液(pH7. 2) 2. 0ml ,在冰浴中研磨,得到的匀浆用高速离心机20000 ×g离心20min ,上清液供测酶活度用

2谷草转氨酶( GOT)活度测定取10ml 试管2支,一支作测定管,分别加酶粗制剂0. 1ml 和GOT 底物液0. 5ml ,另一支作对照管,仅加酶粗制剂0. 1ml。将二管同时置37 ℃水浴,60min后取出,各管加2 ,4 二硝基苯肼液0. 5ml 终止反应,对照管再加GOT 底物液0.5ml。将二管再置37 ℃水浴中20min ,取出后各管加0.4mol/ L NaOH 5. 0ml ,混匀,10min 后用分光光度计比色,波长500nm ,蒸馏水调零点,读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml) 。若查得的丙酮酸体积超过0. 2ml 时应将酶粗制液稀释后再进行测定,测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(ml) 。

工作曲线绘制:取10ml 试管 5 支,各管加0. 1mol/ L 磷酸盐缓冲液0. 1ml ,分别加GOT底物液0. 5、0. 45、0. 40、0. 35、0. 30ml ,丙酮酸标准液0 (对照管) 、0. 05、0. 10、0. 15、0. 20ml。置37 ℃水浴5min ,各管加2 ,4 - 二硝基苯肼溶液0. 5ml ,混匀,再置37 ℃浴中20min ,取出后各管加0. 4mol/ L 氢氧化钠溶液5ml ,混匀,10min后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标,以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线