第八章酶的定向进化

实例
枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成,鞣革和医药领域的重 要工业酶制剂. Chen 和Arnold] 采用易错PCR 对该酶进行了体外进 化研究.他们通过降低反应体系中dATP 的浓度, 对 编码该酶从第49 位氨基酸到C 端的DNA 片段进行 易错PCR , 经筛选得到的几个突变株在高浓度的二 甲基甲酰胺(DMF) 中酶活性明显提高 突变体PC3 在60 %的DMF 中, 酶活力是野生型的 256 倍.将PC3 再进行两个循环的定向进化, 得到 的突变体13M酶活力比PC3 还要高3 倍.
化学诱变剂介导
Taguchi 等 研究表明,用羟胺 (hydroxylamine)在65℃下直接处理带有目 的基因片段的质粒也可产生随机突变,然后 用限制性内切酶切下突变的基因片段,克隆 到一定的表达载体中进行功能筛选.应用此 技术将带有枯草杆菌蛋白酶基因的质粒进行 随机突变,经酶切,克隆表达后得到 13 个突 变株,在 10℃下其 Kcat/Km 比出发菌株提高 1 倍.
8.2 酶的定向进化常用方法
一,易错PCR技术为代表的无性进化 二,DNA改组技术为代表的有性进化
一,易错PCR技术为代表的无性进化
无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突 变,制造突变酶库以便筛选.主要的手段包 括易错PCR,盒式诱变,随机定位诱变等 易错PCR是在采用Taq酶进行PCR 扩增目的 基因时,通过调整反应条件,例如提高镁离 子浓度,加入锰离子.改变体系中四种dNTP 的浓度等,使用低保真度的Taq酶,从而向目 的基因中.以一定的频率随机引入突变构建 突变库,然后选择或筛选需要的突变体.
定点突变的缺点
只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行 替换,删除或插入,不改变酶蛋白的高级结 构,因而对酶功能的改造较有限. 本法仅适用于三维结构清楚,结构和功能的 相互关系也较清楚的酶.当对酶结构不甚了 解时,定点突变就无能为力了.
定向进化
利用基因的可操作性,模拟自然界的演化进程的非合理设计 方案, 定向进化(directed evolution),杂合进化(hybrid evolution)等. 定义: 酶的体外定向进化 vitro directed evolution)是在人 酶的体外定向进化(in 工模拟自然进化过程的条件下,通过容错PCR,DNA 改组, 交错延伸技术,随机引物引导重组和递增截短技术等方法对 经高通量筛选获得性能 编码酶的基因进行突变和体外重组,经高通量筛选 经高通量筛选 更优良或全新的酶.本法不需了解酶的结构信息,因此称为 非理性化设计.
3 发展阶段
易错PCR (error-prone PCR)和DNA改组方法被成 功开发,标志着酶分子定向进化技术的成熟. 1992年Gram H.等用噬菌体呈现技术体外筛选抗 体时,用易错PCR向抗体的重链可变区和轻链可变 区引入突变. Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中, 他用β内酰胺酶作为模型分子,对其正向突变库进 行DNA改组,以逐渐增加头孢氨噻的浓度为筛选压 力,经过三轮DNA改组获得酶活力增加32000倍的 突变体.
定向进化的历史
1 萌芽阶段 首先在分子水平上进行改造 单一分子的是 Sol Spiegelman在20世纪60年代,利用RNA噬 菌体Q进行的试验,目的是证明达尔文的自然 选择也可在非细胞体进行. 病毒基因组 Q复制酶扩增 DNA突变库 复制快的保留(能被Q酶选择识别的)
2奠基阶段
1981年,Hall B G等报道了他们定向改变了 大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专 一性,开发出对几种糖苷键有水解能力的酶. HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌, 分别在含有某种碳源的培养基上培养.从酶 的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖, 乳果糖,乳糖酸的突变酶,而野生型的酶不 能水解这些底物.
实例
Stemmer 等从不同种微生物中选择编码头孢 菌素酶的4 个同源基因, 对它们进行单独进化 和同源重组进化, 来对这两种进化模式进行比 较.在对单基因进化得到的突变酶中, 对头孢 羟羧氧胺的抗性最高的增加了8 倍, 而采用 Family shuffling 的方法使抗性比其中两种微 生物来源的天然酶提高270 倍, 比另两种酶提 高了540 倍.
由致突变株产生
Greener等构建了一株DNA修复途径缺陷的大肠杆 菌突变株 XL1-Red,其体内的 DNA 突变率比野生 型高出 5000 倍.将带有拟突变基因的质粒转化到 XL1-Red菌株内培养过夜,可产生随机突变,频率 一般为 1/2000. 本法产生的随机突变的特点为:(1)每代筛选出1 个最佳的突变体作为下一代的亲本,通过累积正突 变加快进化进程,但要将有益的突变组合到一起较 困难 ;(2)常会发生突变的复原;(3)无法删除 有害突变,连续突变也会累积有害突变,往往导致 进化提前终止.
又称为有性PCR (Sexual PCR) , 其目的是创造将亲 本基因群中的突变尽可能组合的机会, 以致更大的 变异, 获得具有最佳突变组合的酶.基本操作过程 如下: 靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲 本基因群, 用DNase I 随机切割; 得到的片段经过不 加引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些片段之间 互为引物和模板进行扩增, 直至获得全长基因; 再加 入基因的两端引物进行常规PCR , 最终获得发生改 组的基因库(图1) .该技术不仅可加速积累有益突变, 而且可实现目的蛋白多种特性的共进化, 所以无论 在理论上, 还是在实际应用中, 均优于连续易错PCR.
HTS
HTS 现有的方法有: 固相筛选,使用放射性 染料筛选,荧光筛选,闪烁接近化验,LISA, 利用细胞的功能筛选和利用小鼠显型的表型 遗传学筛选等等. 高通量筛选( HTS) 体系将组合化学,基因组 研究,生物信息和自动化仪器,机器人等先 进技术进行了有机组合,快速 筛选得到目的物.
90 年代初期, 一个实验室采用传统的方法, 借助20 余种药物作用靶位, 一年内仅能筛选 75 000个样品; 到了1997 年HTS 发展的初期, 采用100 余种靶位, 每年可筛选1 000 000个 样品; 而到1999 年, 由于HTS 的进一步完善, 每天的筛选量就高达100 000种化合物, 因而, 称之为超高通量筛选.
二,DNA改组技术为代表的有性进化
在酶分子无性进化策略中,一个具有正向突 变的基因在下一轮易错PCR过程中继续引入 的突变是随机的,而这些后引入的突变仍然 是正向突变的概率是很小的. 开发出DNA改组等基因重组策略.将已经获 得的存在于不同基因中的正突变结合在一起 形成新的突变基因库
DNA改组 改组(DNA shuffling) 改组
荧光HTS
8.4 实际应用
一,提高酶分子的催化活力
这是对酶分子进行改造的最基本的愿望之一, 大多实验都涉及对目的酶催化活力的提高, 例如,吉林大学分于酶学工程教育部重点实 验室张今教授课题组对L—天冬氨酸酶,等进 行定向进化研究,以提高催化活力.
实例1;L—天冬氨酸酶定向进化研究
L天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶,可催化富 马酸和氨生成L-天冬氨酸.L-天冬氨酸在医药,食 品,化工等领域具有非常广泛的用途.由于天冬氨 酸酶的活性部位尚未完全确定,催化机理也需进一 步证实,在这种条件下通过酶的合理化设计来进一 步提高酶活力具有一定困难.为此,采用定向进化 的方法对酶基因进行改造,以期获得较高活力的酶.
根据定向进化的基本思想,作者确定了易错 PCR一筛选一(优势突变重组一筛选)n的实验 路线.共进行了4轮易错PCR,每一轮易错 PCR约筛选了3000个菌落.最终得到了一株 酶活力提高28倍的突变体.对天然酶和进化 酶的酶学性质进行了分析,结果表明进化酶 的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶,因此 更适合于工业化生产L—天冬氨酸.
实例
β-内酰胺酶是一种水解头孢类抗生素的微生物 酶,Stemmer 等运用DNA shuffling技术成功地实现 了对该酶的定向进化.他们从对头孢类抗生素具有 较弱抗性的β-内酰胺酶基因出发, 经随机突变, DNA 改组和定向筛选, 得到上百个对头孢类抗生素 抗性较大的克隆, 以这些克隆携带的酶基因作为下 一步DNA 改组的起始基因库, 经3 个循环的改组和 筛选, 最终获得了一个使宿主细胞对头孢类抗生素 抗性性能提高16 ,000 倍的进化酶.
Family shuffling 指用DNA shuffling 技术, 改 组进化上相关的一系列基因. 当从自然界中存在的基因家族出发, 利用它们 之间的同源序列进行DNA 改组.由于每一个 天然酶的基因都经过千百万年的进化, 并且基 因之间存在比较显著的差异, 所以获得的重组 基因库充分体现了基因的多样化,又最大限 度的排除了那些不需要的突变.
第八章 酶的定向进化
8.1 简介
通常可通过两条途径获得具有新功能和特性 的酶 一是从大量未知的生物种系中寻找; 二是改造现有已知的酶.
人工改造之定点突变
首先分析蛋白质的三维空间结构,搞清结构 与功能的关系,然后采用定点突变技术改变 蛋白质中的个别氨基酸残基,从而得到新的 蛋白质,理性化设计. 定点突变技术对天然酶蛋白的催化活性,抗 氧化性,底物特异性,热稳定性及拓宽酶反 应的底物范围,改进酶的别构效应等进行了 成功的改造.
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易错PCR
遗传变化只发生在单一分子内部, 属于无性进化.较为费力, 耗时, 一般多用于较小基因片段( < 800bp) 的改造.通常, 经 一轮的易错PCR,定向筛选, 很难获得令人满意的结果.由 此发展出了连续易错PCR(Sequential error-prone PCR) , 将 一次PCR 扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR 扩增的 模板, 连续反复进行随机诱变, 使得每一次获得的少量突变累 积而产生重要的有益突变.
进化酶基因测序结果表明共发生了7个碱基突 变,其中3个点突变引起了氨基酸的改变: Asn217Lys,Thr233Arg,Val367Gly.Thr位于 亚基间相互作用的界面上,距离 Lys3271.5nm以内,推测突变后的Arg与底物 α—COOH的碳基氧作用,一方面进一步加强 了酶与底物的亲和力,另一方面更加稳定了 负碳离子中间体.从而引起了进化酶K m的 下降和Kcat值的提高.L—天冬氨酸酶活性位 点的重要催化残基没有改变,暗示该进化酶 的催化机理与天然酶相同.
常用方法
利用底物显色反应 改变培养条件(如逐步提高培养温度, 或改变培养基 的pH 等) 利用某些蛋白的固有性质,如产生绿色荧光 高通量筛选(HTS: High Throughout Screening) , 该 技术可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相 筛选, 也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合 性筛选, 酶活性筛选, 细胞活性筛选等.
特点
(1)DNase I酶切获得片段大小一般应控制 在20～50bp; (2)伴随重组程的不断重复,可有少数点突 变同时发生; (3)可体外实现同源序列间的改组,创造亲 本基因群中突变尽可能组合在一起的机会, 加速累积有益突变最终获得较理想的性状改 良的突变体
基因家族之间的同源重组 基因家族之间的同源重组 Family shuffling
改进方法
其它改组方法
交错延伸重组( 交错延伸重组 StEP : Stagger extension process) 随机引物体外重组( 随机引物体外重组 RPR: Random2priming in vitro recombination) 临时模板随机嵌合生长( 临时模板随机嵌合生长 RACHITT : Random chimeragenesis on transient templates)
8.3
酶分子定向进化的筛选策略
与基因的定点突变不同, 在酶分子的定向进化 中,突变是随机发生的, 但通过筛选特定方向 的突变, 便可限定进化的趋势, 再加上适当的 控制实验条件, 不仅可大大的减少工作量, 还 加快了酶某种特征的进化速度. 通常, 采用的定向筛选方法必须灵敏, 且应与 目的性质相关