原核表达真核基因

蜱铁蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达分析

系别：生物工程班级：06-4

组别：D组

组员：广慧娟学号：06031405

关程程学号：06031404

尹晓欢学号：06031427

孙恒一学号：06031417

刘博学号：06031413

指导教师：刘宝全

完成日期：2009-6-29

目录

一、概述 (1)

二、蜱铁蛋白DNA、MRNA、氨基酸序列的获取 (2)

1、蜱铁蛋白DNA (2)

2、蜱铁蛋白M RNA序列 (2)

3、蜱铁蛋白氨基酸序列 (5)

三、蜱铁蛋白相关信息（网站、文献查阅） (5)

四、材料和方法 (6)

1、材料 (6)

1.1蜱的饲养及试验动物 (6)

1.2 质粒和宿主菌株 (4)

2、方法 (7)

2.1蜱总RNA的分离及cDNA的合成 (7)

2.2 引物设计和PCR扩增目的基因 (7)

2.3目的基因的克隆和测序 (8)

2.4铁蛋白基因的原核表达及亲合纯化 (10)

2.5 WesternBlot方法检测微小牛蜱铁蛋白（文献查阅） (12)

五、相关说明： (13)

1、表达载体的选择 (13)

2、克隆载体与表达载体的区别 (13)

3、如何提高外源基因片段在原核细胞中的表达量 (13)

参考资料 (16)

一、概述

蜱是一类以吸血为生的节肢动物，蜱类不仅在人、畜体上刺吸血液，造成宿主的血液损失，而且引起皮肤奇痒，伤口发炎、水肿等多种反应。更重要的是，作为人和动物的许多病原的传播媒介，包括细菌、真菌、病毒、立克次体、螺旋体和寄生原虫等多种病原。微小牛蜱也是兽医上常见的体外寄生虫,是传播牛疾病最多的一种蜱,可传播牛巴贝斯虫病、牛双芽巴贝斯虫病和牛边缘边虫病。

据联合国粮农组织(FAO)统计，世界上有80%的牛被侵袭，仅硬蜱给畜牧业造成的损失，全球每年就高达70亿美元。

长期以来，药物灭蜱一直是蜱及蜱传播疾病的主要控制手段，由于蜱抗药性出现、食品安全和环境污染等问题,目前的药物控制已显现出它严重的局限性,迫切需要寻找新的防制策略。1995年研制出微小牛蜱的肠抗原Bm86的重组疫苗，它的成功使人们确信，免疫控制是目前最有希望的方法之一。但该疫苗不足之处也十分明显，该疫苗的局限性激励有关学者寻找其他分子。生物技术和信息技术的快速发展为蜱的功能分子的研究提供了有力的手段。从现有的研究看，蜱体内具有多种疫苗侯选价值的分子，例如，蜱铁蛋白、抗凝血分子。、免疫调节分子等。

蜱功能分子的具有良好的开发前景：

1、作为抗蜱疫苗的应用，现在从蜱体分离出的许多抗原分子例如微小牛蟀Bm86以及本实验分离的半胱氨酸蛋白铁蛋白具有一定的免疫保护作用。

2、抗病原传播疫苗的应用。蜱的危害不仅是作为寄生虫，更重要的作为传播病原的媒介。如果能够用从蜱体分离出的特定病原的抗原对宿主进行免疫，使蜱叮咬宿主后，降低或使蜱丧失媒介能力，则能达到阻断病原的传播。

3、寻找抗药性对策。蜱抗药性问题一直是药物灭蜂的一个突出问题，且大量化学药物的使用容易造成环境污染和食品污染。研究表明，蜱体内一些酶分子是与抗药性产生相关的，因此，这些分子的研究有助于寻找抗药性对策。

铁是一种重要的营养元素，但它的富集能致毒。铁蛋白是普遍存在于生物体内的一种保守性较高的多功能多亚基的生物蛋白，其作用是贮存铁和对生物体内铁含量进行调控，因此在生物体内铁含量过多时起到解毒的作用。

蜱是以吸血为生的寄生虫，宿主红细胞中含有大量的铁，据研究，蜱是利用

铁蛋白及其相关蛋白功能来处理大量的铁以消除对自身的毒性。因此铁蛋白是蜱体内一种十分重要的功能分子，为了进行抗蜱疫苗的研制，本研究对微小牛蜱铁蛋白编码基因进行克隆、测序、表达和分析。

二、蜱铁蛋白DNA、mRNA、氨基酸序列的获取

1、蜱铁蛋白DNA

1 GTTTTGCTTC AACAGTGATT GAACGAG CAT CGCCAAACGT GCTCTCTCTC TCTTCCGATC

61 CTTTCTCGCT AAATTAATCT TGAAGTACAG TTTGAGATCC CGTCCGCCAA GCAGCCGAAG

121 AAG ATGGCCG CAACTCAGCC C CGTCAGAAC TACCATGTCG ATTGCGAAGC CCGCATCAAC

181 AAGCAGATCA ACTTGGAACT CTACGCGAGC TACGTCTACA CATCAATGGC CTACTACTTC

241 GATCGCGATG ATGTGGCACT GCCGGGATTC CACAAGTTCT TCAAGAAGAG CAGCGATGAG

301 GAGCGTGAGC ATGCCCAGAA GCTGATGAAG TATCAAAACA TGCGCGGAGG GCGCGTGGTG

361 CTGCAGGCGA TACAGAAGCC ATCGCGGGAC GAATGGGGCG CAGGCTTGGA CGCCATGCAG

421 GCTGCACTTG AGCTGGAGAA GACTGTCAAC CAGTCACTGC TGGACTTGCA CAAGCTGGCA

481 AACGATCATA ATAACGCTCA GCTGTGCGAC TTCCTGGAAA GCGAGTACCT GGAAGAGCAG

541 GTGAAGGCTA TCAAGGAGCT GTCTGACTAC GTGACCAACC TGAAGCGTGT TGGCCCTGGC

601 CTCGGAGAGT AC ATGTTTGA CAAGGAGACC CTATCAGAC T GA

注：红色序列代表步骤2.2.1中所设计的引物序列

蓝色序列代表步骤2.4.2中所设计的引物序列

2、蜱铁蛋白mRNA序列

GUUUUGCUUCAACAGUGAUUGAACGAGCAUCGCCAAACGUGCUCUCUCUCUCUUCCGAUCCUUUCUCGC UAAAUUAAUCUUGAAGUACAGUUUGAGAUCCCGUCCGCCAAGCAGCCGAAGAAGAUGGCCGCAACUCAG CCCCGUCAGAACUACCAUGUCGAUUGCGAAGCCCGCAUCAACAAGCAGAUCAACUUGGAACUCUACGCG AGCUACGUCUACACAUCAAUGGCCUACUACUUCGAUCGCGAUGAUGUGGCACUGCCGGGAUUCCACAAG UUCUUCAAGAAGAGCAGCGAUGAGGAGCGUGAGCAUGCCCAGAAGCUGAUGAAGUAUCAAAACAUGCGC GGAGGGCGCGUGGUGCUGCAGGCGAUACAGAAGCCAUCGCGGGACGAAUGGGGCGCAGGCUUGGACGCC AUGCAGGCUGCACUUGAGCUGGAGAAGACUGUCAACCAGUCACUGCUGGACUUGCACAAGCUGGCAAAC GAUCAUAAUAACGCUCAGCUGUGCGACUUCCUGGAAAGCGAGUACCUGGAAGAGCAGGUGAAGGCUAUC AAGGAGCUGUCUGACUACGUGACCAACCUGAAGCGUGUUGGCCCUGGCCUCGGAGAGUACAUGUUUGAC AAGGAGACCCUAUCAGACUGA