外源基因的原核表达 PPT课件

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在进行融合表达时，一般将受体菌 蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。 外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋 白的方式表达后其稳定性大大增加。 其原因为：外源小分子蛋白上的酶
切位点暴露于分子的表面。当以融 合蛋白的形式表达后，外源蛋白部 分在菌体自身蛋白的引导下正确折 叠，可最大程度上封闭酶切位点。
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表达蛋白在细胞中的稳定性 常用的措施有： 1、构建融合蛋白表达系统 2、构建分泌蛋白表达系统 3、构建包涵体表达系统 4、选择蛋白水解酶基因缺陷受体系 统
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外源基因在大肠杆菌中表达产物在 细胞的位置：外源基因在大肠杆菌 中的表达产物可能存在于细胞质、 细胞周质和细胞外培养基中。其表 达形式包括形成：
因，而在细胞内积累大量的异源蛋 白极易被降解。造成重组异源蛋白 在大肠杆菌中不稳定的原因有： 1、大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加 工和蛋白质折叠系统；
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2、大肠杆菌不具备类似真核细胞 的亚细胞结构和表达产物稳定因子；
3、大量的异源重组蛋白在大肠杆 菌细胞中形成高浓度微环境，导致
的引导下成为分泌蛋白。
表面展示载体：将目的基因克隆到
细菌表面蛋白的结构基因中，从而
达到细菌表面表达。
带分子伴侣的表达载体：
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宿主菌 大肠杆菌表达系统表达的基因一般
都是异源基因，甚至是真核生物基
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终止子的功能
（1）、能能有效控制目的基因 mRNA的长度
（2）、提高mRNA的稳定性
（3）、避免载体上其他基因的异常 表达
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大肠杆菌基因表达载体
5、核糖体结合位点：原核细胞 mRNA蛋白合成起始点上游的一段 非编码序列。能与30S小亚基中16S rRNA3’末端的一段序列特异结合。 此序列富含嘌呤，核心序列为SD序 列。
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常用的原核外源表达系统
大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统
链霉菌表达系统 蓝藻表达系统
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原核生物基因表达系统的特点：
1、原核生物大多数为单细胞异养， 生长快，代谢易于控制，可通过发 酵迅速获得大量基因表达产物。 2、基因组结构简单，便于基因操作 和分析。 3、多数原核生物细胞内含有质粒或 噬菌体，便于构建相应的表达载体。
外源基因在受体细胞中的表达包括：
1、转录 2、翻译
两个环节
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基因表达的机制
基因工程的核心问题：有效表达 外源基因表达的关键步骤：起始转录 基因表达的限速步骤：转录起始的速率 构建表达系统时首先要考虑的问题是： 1、选择可调控的启动子 2、相关的调控序列
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大肠杆菌表达系统是基因表达技术 中发展最早，目前应用最为广泛的 经典表达系统。属革兰氏阴性细菌。 其特点是：
遗传背景清楚
目的基因表达水平高
培养时间短
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大肠杆菌表达系统的主要不足
• 1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰 和加工过程。
• 2、表达的蛋白质多以包含体形式存在， 需经复性才能恢复构象与活性
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mRNA的有效延伸：导致mRNA转 录提前终止的可能原因有和解决办 法
1、衰减子：类似于简单的终止子， 在原核生物中一般位于操纵子的启 动子与第一个结构基因之间。在构 建表达载体时应避免该序列的存在。
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2、非特异终止：防止非特异性终止 的方法是在构建表达载体时加入抗 终止的序列元件。
中含量的途径很难操作，因此在构建表达体系时， 选用温度敏感突变体cl1857(ts)的基因产物调控PL 和PR启动子的转录。
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常见的大肠杆菌表达系统
• T7表达体系：利用大肠杆菌T7噬菌体转录 系统元件构建的，具有很高表达能力的表 达系统。T7噬菌体RNA聚合酶能选择性地 激活T7噬菌体启动子的转录，这是一种活 性很高的RNA聚合酶，其合成mRNA的速 率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。在大 肠杆菌宿主细胞中，受T7噬菌体启动子控 制的基因在T7噬菌体RNA聚合酶存在下进
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目的：在细胞生长的初期不表达或低 水平表达，当细胞增殖到一定的密度 时，在某种特定的诱导因子的诱导下
启动转录合成mRNA。
诱导型 启 原核生物启动子 组成型
动
子
诱导型 真核生物启动子
组成型
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mRNA的延伸与稳定性： 有效表达的关键是：保持mRNA的 1、有效延伸 2、正确终止 3、mRNA在细胞中的稳定存在
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大肠杆菌基因表达载体
3、启动子：是与DNA依赖的RNA 聚合酶相结合的一段DNA序列。启 动子是调控外源基因转录的重要顺 式作用元件，与mRNA的合成有很 大关系，是表达载体不可缺少的元 件。
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大肠杆菌基因表达载体 4、终止子：在转录过程中能在特异 位点将转录终止的DNA序列。有两 种类型
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大肠杆菌高效表达目的基因策略
对表达相关元件进行优化 提高稀有密码子tRNA的表达作用 提高外源基因表达产物的稳定性 提高外源基因mRNA的稳定性 优化发酵过程
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表达相关元件的优化
主要包括与表达相关的启动子序列 和决定mRNA翻译的SD序列。具体 方法为组合强启动子和强终止子； 增加SD序列中与核糖体16SrRNA 互补配对的碱基序列；调整SD序列
• 3、宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复 杂。
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大肠杆菌基因表达载体
理想的大肠杆菌表达载体的特征 1、稳定的遗传和复制能力，在无选
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
水平较低 4、转录的mRNA能够在适当的位置
终止且转录不影响载体的复制 5、具备适用于外源基因插入酶切位
行高表达。
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常见的大肠杆菌基因表达受体菌株
菌株
基因型
启动子
BL 21
hsd S gal
T 7噬菌体
HMS174 M5279 RB791
recA1 hsdR rif lacZ trpA rpsL W3110 lacIq L8
T 7噬菌体 λ 噬菌体PL
lac,tac
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蛋白质分子之间的作用增强。
由于以上原因，为使外源基因 高效表达，必须构建作为基因表达 受体菌的工程菌株。
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常见的大肠杆菌表达系统
• Lac和Tac表达系统：以lac操纵子调控机制 为基础设计和构建的表达系统。通过对大 肠杆菌tac I 基因诱变，获得能过量表达lac I 阻遏蛋白的基因突变体lac Iq，使外源基因 的表达调控在一定的水平。此外，目前还 构建了阻遏蛋白温度敏感型突变体lac Iq(ts) 宿主菌和载体，使lac和tac启动子的转录受 温度的控制，在低温(30oC)下基因的转录受 到抑制，在(42oC)下基因的转录保持开放。
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原核生物基因表达系统的特点： 4、不具备真核生物的蛋白质加工系 统，表达产物无特定的空间构象。 5、内源蛋白酶会降解表达的外源蛋 白，造成表达产物的不稳定。
由于以上特点，近年来真核生物表 达系统发展很快，并构建了相应的 基因表达载体。
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大肠杆菌表达系统
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带纯化标签的表达载体：载体上具有 一段特殊序列，该序列表达后可作为 纯化标签。目的基因与该序列融合表 达后，用亲和层析的方法很方便的将
目的蛋白分离，切除标签序列后可得
到纯化的目的蛋白。
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分泌型表达载体：将目的基因与信 号肽融合表达，表达蛋白在信号肽
1、不溶性蛋白
2、可溶性蛋白
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大肠杆菌载体的表达方式
非融合表达载体 融合表达载体 带纯化标签表达载Βιβλιοθήκη Baidu 分泌型表达载体 表面展示表达载体 带分子伴侣表达载体
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1、非融合表达载体：应用此种载体 表达的蛋白质与天然状态下存在的蛋 白质在结构、功能和免疫原性等方面 基本或完全一致。目前上市的细胞因 子类产品多采用此类表达载体。 2、融合表达载体：分子量较小的蛋 白质常用此类载体进行表达。将外源 蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组 在一起，但不改变两个基因阅读框。
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大肠杆菌基因表达载体
6、密码子：密码子有简并性，多个 密码子为一个氨基酸进行编码，不 同生物在利用这些密码子时其利用 频率不同，不同的密码子会影响到 大肠杆菌的翻译速度。
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基因表达的机制
基因工程技术的核心是基因表达技术。 迄今为止，已构件建了不同类型的表达 系统，可根据需要合理地选择适当的表 达系统。
与起始密码ATG之间的距离及碱基 的种类；防止核糖体结合位点附近 序列转录后形成发卡结构。
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表达质粒的优化和设计
构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序 列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。
核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表 现为：
点
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大肠杆菌基因表达载体构成
1、复制子：是一段包含起始位点和 反式因子作用区在内的DNA片段。 其功能是通过复制使载体稳定存在 于大肠杆菌细胞。
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大肠杆菌基因表达载体
2、筛选标记：大肠杆菌经过转化后， 仅有少数细菌能获得携带外源基因 的质粒并稳定地传代，筛选标记可 有效地筛选出转化有外源基因的阳 性重组。
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常见的大肠杆菌表达系统
• PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启 动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和 PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或 溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产
物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在
细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子这 间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞
1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
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外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
1、ρ－因子型终止子
2、转录产物二级结构
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大肠杆菌基因表达载体 4、终止子： 能在特异位点终止转 录的DNA序列。终止子有两种类型
1、ρ－因子
2、转录产物二级结构
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外源基因表达的作用：外源基因表达泛指 目的基因与表达载体重组后，导入合适的 受体细胞，并能在其中有效表达，产生目 的基因产物。外源基因的表达是研究和探 索基因功能、基因表达调控机制、编码蛋 白质的结构与功能的重要方法，也是制备 和生产新型蛋白质药物、诊断试剂必不可 少的手段。通过外源基因的表达可由宿主 细胞产生大量的目的蛋白。
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转录的正确终止也是外源基因有效 表达的重要因素，可以防止产生不 必要的转录产物，使mRNA的长度 限制在一定的范围内，从而增加外 源基因表达的稳定性。 原核生物解决办法 真核生物解决办法
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mRNA在细胞中的稳定存在：mRNA在 受体细胞中的稳定存在直接决定翻 译产物的多少。解决办法
SD 序列 UAAGGAGG 的翻译效率要比 AAGGA 高3～6倍 翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是 6～8 个碱基长度， 与 AAGAA 的最适距离是5～7 个碱基长度 ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3 ～ 4个碱基，与 AAGAA 至少相隔 5 个碱基； mRNA 的翻译才能进行 ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效 率较高。