外源基因的原核表达系统

优化发酵过程既包括工艺方面的因素，也包括生物方面的因素。
利用原核表达系统生产真核 蛋白质的实例
干扰素基因工程
干扰素是一类多功能蛋白质，具有抗病毒、抗肿瘤、抗细胞分 裂以及调节免疫功能的作用，因而通过基因工程生产干扰素具有重 扰素、（β）成纤维素干扰 素、（γ）免疫干扰素。目前，白细胞干扰素和成纤维素干扰素基 因的结构基本了解：5’端有一段非翻译序列，紧接着一段先导序列， 其后是干扰素基因，编码166个氨基酸，再后是3’非翻译区，末端 是多聚A。
hGH编码的前24个氨基酸的DNA片段克隆
先人工合成6个小片段U1-U6，再依次将6个片段连接为一个较大的 片段，该片段两端分别为EcoRI和HindIII黏性末端。利用酶切位点 与pBR322相连，形成重组载体，转化大肠杆菌进行扩增。
hGH编码24-191个氨基酸的DAN片段克隆
利用反转录酶法，从人垂体提取mRNA反转录成cDNA，再合成第 二链，用HaeIII切割，利用琼脂糖凝胶电泳分离纯化551bp的DNA 片段，经末端转移酶的作用在3’端加入多聚C尾，再在pBR322上加 入多聚G尾，使二者重组，对大肠杆菌进行转化，扩增。 hGH基因的克隆 将两部所得质粒酶切，连接，重组到含有LacUR-5启动子和四环素 标记的载体上，转化大肠杆菌，筛选，表达。
3.提高外源基因mRNA的稳定性
多数情况下，细菌的mRNA的半衰期很短，而外源基因mRNA的半 衰期更短，若能增加外源mRNA的稳定性，就有可能提高外源基因 的表达水平。 4.提高表达蛋白的稳定性，防止其降解 原核细胞中外源蛋白往往不够稳定，易被蛋白酶降解从而使蛋白质 产量降低。采取措施提高目的蛋白的稳定性，减少目标蛋白的降解 从而提高目的基因的表达水平。
我国科技工作者研制干扰素领域已获得成功，通过基因工程生产的 人αI型干扰素已于1990年正式投放市场。
生长激素基因工程
人生长激素来自垂体，作为药物可以用于治疗儿童的侏儒症、 烧伤、伤口愈合，以及预防老年患者肌肉萎缩等。前体生长激素的 N端有一段23个氨基酸的信号肽，去掉信号肽之后就可以成为成熟 的生长激素。 在体外人工合成了起始密码ATG与编码前1-23个氨基酸的DNA 片段并用反转录酶法合成了编码24-191个氨基酸的DNA序列，将两 者连接后，转入大肠杆菌成功表达。
IFN-cDNA的制备
从诱发产生干扰素的白细胞中提取mRNA 分级分离 把不同部分的mRNA分别注射到爪蟾卵母细胞中 检测干扰素抗病毒活性
活性最高的mRNA反转录成cDNA
IFN-cDNA的修饰
在cDNA两端连接EcoRI识别序列，并在5’端连上信号序列。 IFN-cDNA克隆修饰的cDNA与表达载体pBR322或YEpIpT连接，形 成重组载体，转化大肠杆菌，表达分泌干扰素。
胰岛素基因的克隆表达
鼠胰岛素原cDNA连在pBR322上，转化大肠杆菌进行克隆；
人的胰岛素DNA将A肽和B肽的DNA片段分别于pBR322相连，通过对大 肠杆菌转化儿进行克隆； 鼠胰岛素使用PL启动子，基因产物为融合蛋白，在β -内酰胺酶信 号肽的作用下，穿过胞膜分泌到胞外。 人胰岛素使用β -半乳糖苷酶启动子，表达融合蛋白β -半乳糖苷酶 -A肽，β 半乳糖苷酶-B肽，经溴化氢处理后，得A肽与B肽，通过双 硫键的结合，成为成熟的人胰岛素分子。
5.减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平
外源基因在宿主细胞内过度表达，必然影响宿主细胞的生长和代谢， 而宿主细胞的代谢失常又会影响目标蛋白的表达。采取诱导表达和 讲宿主菌生长和表达质粒的复制分开等方式，平衡宿主细胞生长于 目标蛋白表达这二者之间的矛盾。 6.优化发酵条件
在进行工业化生产时，工程菌株在大规模培养时培养条件的优化控 制对外源基因的高效表达至关重要。
胰岛素的英文缩写，INS. （insulin）
胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现 1955年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列
1965年9月17日，中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶 牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质
胰岛细胞根据其分泌激素的功能分为以下几种： ①B细胞(β细胞)，约占胰岛细胞的60%～80%，分泌胰岛素， 胰岛素可以降低血糖。 ②A细胞(α细胞)，约占胰岛细胞的24%～40%，分泌胰升糖素， 胰升糖素作用同胰岛素相反，可增高血糖。 ③D细胞，约占胰岛细胞总数的6%～15%，分泌生长激素抑 制激素
胰岛素立体结构
胰岛素的性质
〖化学本质〗蛋白质
〖分子式〗C257H383N65O77S6 〖分子量〗5807.69 〖性状〗白色或类白色的结晶粉末 〖熔点〗233℃（分解） 〖比旋度〗-64°±8°(C=2,0.003mol/L NaOH) 〖溶解性〗在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；在矿酸（无机酸） 或氢氧化碱溶液中易溶 〖酸碱性〗两性，等电点pI5.35-5.45
胰岛素生物合成的控制基因在第11对染色体短臂上。在β 细胞
的细胞核中，第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录， mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成由105个氨基酸残基构
成的前胰岛素原。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86
个氨基酸组成的长肽链——胰岛素原。胰岛素原随细胞浆中的微泡 进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三个精氨酸
α -淀粉酶基因工程
α -淀粉酶普遍应用于食品、酿造、轻工业纺织、造纸、制药等工 业中。热稳定α -淀粉酶已逐步取代中温α -淀粉酶，并由微生物进 行生产。
通过基因工程的手段，将地衣芽孢杆菌的热稳定α -淀粉酶基 因转移到枯草杆菌中，可以显著提高产量。
胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子 量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。
所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治 疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链 第30个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用 基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。 胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素A链有11种21个氨基 酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中 A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形 成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与 A11(Cys)之间也存在一个二硫键。
将人工合成的生长激素抑制因子基因转进大肠杆菌细胞，并得到了 基因产物，这是人类首次实现了真核基因在原核细胞中的表达。
胰岛素基因工程
胰岛素是一种蛋白质类激素,体内胰岛素是由胰岛β细胞分泌的。 在人体十二指肠旁边，有一条长形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布 着许许多多的细胞群，叫做胰岛。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或 外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而 分泌的一种蛋白质激素。 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、 脂肪、蛋白质合成的激素。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。
连接的链，断链生成没有作用的C肽，同时生成胰岛素，分泌到β
细胞外，进入血液循环中。未经过蛋白酶水解的胰岛素原，一小部 分随着胰岛素进入血液循环 。
胰岛素的分类
动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛 素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不 同，因而易产生抗体 半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相 同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素 生物合成人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成 人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全 相同
生长激素释放抑制因子基因工程
生长激素释放抑制因子来自哺乳动物的下丘脑。主要抑制生长素、 胰岛素、胰高血糖素等多种激素的产生，可以用于治疗肢端肥大症、 胰腺炎、糖尿病等。
将人工合成的生长激素释放抑制因子基因连在pBR322上并加上了 乳糖操纵子调控，重组分子含有氨苄青霉素抗性以及乳糖发酵标记。 基因产物不易被细胞内源性酶消化。
外源基因的原核表达系统
2014-12-1
提高外源基因表达水平的措施
提高外源基因的表达效率，一般要考虑以下几个原则
1.优化表达载体的设计 在构建表达载体时，对决定转录起始的启动子序列和决定mRNA翻 译的SD序列进行优化，要求SD序列与翻译起始位点AUG的距离要 合适，这样才能获得目的蛋白的高水平表达。 2.避免使用稀有密码子 密码子具有简并性，大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现出较大 的偏爱性，同义密码子使用的频率与细胞内相应的tRNA的丰度正 相关，稀有密码子的丰度极低。在mRNA的翻译过程中，往往会由 于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的 tRNA供不应求，最终造成翻译终止或移码突变。