第四章-第五讲-结晶、浓缩、干燥、成型和检测指标

酶液浓缩方法 （1）胶过滤浓缩 （2）聚乙二醇浓缩
小量样品浓缩
（3）反复冻融浓缩
（4）超滤浓缩 （5）蒸发浓缩
工业上处理大量物料
（1）胶过滤浓缩
此法较为温和，没有pH与离子强度的变化，对酶的活性影响 较小，且操作简单，实验室应用比较广泛。
（2）聚乙二醇浓缩
将干的PEG粉末涂抹在装有酶溶液的透析袋外表面，在4℃下， PEG吸收水和盐类，从而使酶液得以浓缩。
（3）反复冻融浓缩
熔点
酶溶液 水 高 低
冰点
低 高
浓缩液
①
缓慢升温
缓慢冷却
浓缩液
②
（4）超滤浓缩
灰尘 灰尘 细菌 病毒 生物大分子 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
生物小分子
盐类 水
超滤（UF）
纳滤（NF）
（5）蒸发浓缩
低温真空蒸发
降膜蒸发
薄膜蒸发
升膜蒸发 升降膜蒸发
(1)低温真空蒸发
免疫电泳：只有一条带，纯
高效液相色谱：单峰出现，纯
三、酶制剂的质量标准
外观性状 固体（U/g)
一般工业酶制剂
酶活力
液体（U/ml) 酶制剂使用方法 活力保持率
食品和医药酶制剂: 纯度高，需表明的指标有酶活力，
活力保持率、卫生指标、有害物 质限量指标等
酶法分析用酶：要求纯度高，不含有与其催化活性相近
(2)薄膜蒸发
降 膜 蒸 发 浓 缩
升 膜 蒸 发 浓 缩
升降膜蒸发浓缩
三、固体酶制剂的干燥
喷雾干燥法 热风干燥 真空干燥法 真空冷冻干燥法
（1）喷雾干燥法
高温短时，酶活力损失小。
(2)气流干燥
50~55℃的热风吹过湿物料表面带走水分。干燥时 间较长，酶活力损失较大。
（3）真空干燥法
①等电点结晶法
②温度诱导结晶法
（4）平衡透析法
盐析结晶法、有机溶剂结晶法、等电点结晶法
派生
平衡透析法
透析袋
酶液
盐溶液（或有机溶剂或接近酶pI 的缓冲液）
（5）气相扩散法
等电点结晶法
派生
气相扩散结晶法
酶液
挥发性酸
二、稀酶液的浓缩
浓缩是从稀溶液中除去一部分溶剂（水），使其 变成浓缩液的工艺。
5mL、 50mL、5L、5吨的稀酶液 如何进行浓缩？
12-20%蔗糖可提高在喷雾干燥时的稳定性，加1-5%的 钙盐可增强贮藏稳定性。 纯酶制剂中，常加酶的底物、辅酶或竞争性抑制剂，加 非酶蛋白质、巯基保护剂等，作为贮藏稳定剂。
（4）填充剂
主要目的是调节酶活力达到出厂标准。
制革、造纸用酶：白陶土、硅藻土等； 纺织工业用酶：面粉、淀粉、三磷酸盐、碳酸钙粉等；
食品工业用酶：淀粉、食盐、蔗糖、葡萄糖、乳糖等；
医药用酶：葡萄糖、蔗糖、酪蛋白、食盐等。
五、药用酶除去热源
影响：热源进入人体将引起发烧等应激反应； 本质：热源是细菌分泌的一类内毒素，是相对分子质量 在10万以上的糖蛋白和脂肪A； 特性：耐高温、耐酸，不耐碱，对强氧化剂较敏感。
除去热源的方法：超滤、凝胶过滤、阴离子交换 剂吸附等。
第七节 酶液的结晶、浓缩、干燥与成型
第八节 酶液的结晶、浓缩、干燥与成型
一、结晶
1、结晶的一般原理
结晶是指控制适当的条件，使溶液中的溶质以 晶体形态从溶液中析出的工艺过程。
不饱和 溶液 饱和 溶液 过饱和 溶液
（无排列排 析出沉淀（快） 队机会）
析出结晶（慢）
2、结晶“三步曲”
第一步：形成过饱 和溶液
的杂酶和杂质
4、酶结晶的方法
（1）盐析法 （2）有机溶剂结晶法 （3）pH值或温度诱导法 （1）平衡透析法 （2）气相扩散法
（1）盐析结晶法
饱和(NH4)2SO4溶液
低温静置
浑浊状态
（2）有机溶剂结晶法
有机溶剂
冰箱中静 置1-2h 离心除沉淀
冰浴
浑浊状态
低温静置
（3）pH诱导结晶法、温度诱导结晶法
酸或碱
六、酶产品的保存
尽量低温（0 ℃~4℃），少量精制的纯酶在-20℃保 存； 干燥保存（包装袋不透湿）； 避阳光直射。
第八节 酶的纯度和酶制剂的质量
一、酶纯化过程的纯度检测
• 1、总活力的回收率—通过测定酶活：
反映提纯过程中酶活力损失的情况
纯化后总活力 100% 总活力的回收率= 纯化前总活力
边加热边抽真空除去水分。
（4）真空冷冻干燥法
先冷冻结冰，再抽真空使水升华而被抽走。
四、酶制剂的成型
（1）酶粉粘结剂：无毒的含结晶水的盐类。
如十水硫酸钠、十水碳酸钠、十二水磷酸氢二钠等。 食品和医药用酶，常用五水乳酸钠、五水柠檬酸钠、六 水琥珀酸钠、三水乙酸钠等
（2）颗粒酶成型剂：聚乙烯醇或其类似物。 （3）酶稳定剂：
稍微越过饱和状态，处于介稳态，浓 缩、降温、调节pH至pI，可使溶液 趋于过饱和。
第二步：形成晶核
过饱和溶液在一定条件下可形成极微 小的有序排列的固相物，成为后续晶 体生长的核心，称为晶核。
第三步：晶体生长
溶质在晶核周边不断有序排列，晶体 逐步长大。
3、结晶条件
（1）酶的纯度——一般酶纯度应达到50%以上。 （2）酶蛋白的浓度——对大多数酶来说，蛋白质浓 度在3~50mg/mL 较好。 （3）晶种——有些不易结晶的酶，需加入微量的晶 种才能形成结晶。 （4）温度—— 一般控制在0~4℃范围内。 （5）pH值——一般选择在被结晶酶的pI值附近。
Folin酚法 2、比活力提高倍数—测定比活力 考马斯亮蓝G-250法 蛋白质含量 双缩脲法 紫外法 反映纯化方法的效率 凯氏定氮法 酶活
•
纯化后的比活 纯化倍数= 纯化前的比活
示例பைடு நூலகம்
二、酶的纯度鉴定
凝胶层析：单峰出现，纯 根据分子大小和形状
等密度梯度离心：只有一个沉降带，纯
离子交换层析：单峰出现，纯 根据分子的电荷性质 等电聚焦电泳：只有一条带，纯 SDS-PAGE：只有一条带，纯 根据多肽链的末端分析：一种蛋白质只有一种C和N端。 免疫沉淀：只有一条免疫沉淀线，纯 酶蛋白的免疫学性质鉴定 用目的蛋白免疫动物，制 备免疫血清。