Westernblot试剂配制及操作步骤(可编辑修改word版)

Western blot

试剂配制

1．30％丙稀酰胺储存液

丙稀酰胺29g

N，N’-亚甲双丙稀酰胺1g

双蒸水定容到100ml，

经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8

Tris 碱90.75g

双蒸水400ml

用浓HCl 调pH 至8.8，加双蒸水定容至500ml。4℃冰箱保存

3．1.0 M Tris pH6.8

Tris 碱12g

双蒸水60ml

用浓HCl 调pH 至 6.8，

加双蒸水定容至100ml。4℃冰箱保存

4．10％SDS(w/v）

SDS 10g

溶于加水至100ml，室温放置

5．10％过硫酸胺（10%APS）

过硫酸胺1g

溶于10ml 双蒸水中。可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液

Tris 30.3g

甘氨酸144g

SDS 10g

定容至1000ml 室温放置。临

用时稀释成1×电泳缓冲液

7．1%溴酚蓝（w/v）

溴酚蓝

Tris-base MilliQ 水

100 mg

60 mg

定容至 10 ml

8．TEMED 原液，4℃冰箱保存

9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)

1.0 M Tris pH6.8

2.5ml SDS

0.8g DTT

0.3085g

甘油

3ml

溴酚蓝

0.004g

加双蒸水至 10ml ，分装—20℃保存

10. 4×SDS 加样缓冲液 10ml

Takara

500ul 每管分装，使用前将 25ul 的 2-ME 加到没管中

11. 转膜缓冲液

Tris 碱

5.8g

甘氨酸

2.9g

SDS

0.37g

甲醇

200ml

加双蒸水至 1000ml ，临用前配制，4℃冷却

1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.004g 甘油

4ml

5x buffer

总 5ml 1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25ml SDS 0.5g 溴酚蓝 BPB

25mg

甘油 2.5ml

12．1×TBST

Tris 碱 3.0285 g

氯化钠8.766g

Tween-20 500ul

加双蒸水至1000ml，现配现用。（4℃最多保存一周）

13．n%封闭液(一般5%)

脱脂奶粉n 克溶于100ml 1×TBST，4℃冰箱保存

附表 1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液

不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50 6%

水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10

1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3

2.5

3.8 5 6.3 7.5 10 12.5

10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04 8%

水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2 30%丙烯酰胺溶液 1.3 2.7 4 5.3 6.7 8 10.7 13.3

1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3

2.5

3.8 5 6.3 7.5 10 12.5

10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03 10%

水 1.9 4 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%丙烯酰胺溶液 1.7 3.3 5 6.7 8.3 10 13.3 16.7

1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3

2.5

3.8 5 6.3 7.5 10 12.5

10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 12%

水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5 30%丙烯酰胺溶液 2 4 6 8 10 12 16 20

1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3

2.5

3.8 5 6.3 7.5 10 12.5

10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 15%

水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5 30%丙烯酰胺溶液 2.5 5 7.5 10 12.5 15 20 25

1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3

2.5

3.8 5 6.3 7.5 10 12.5

10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

附表2 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶（浓缩胶）所用溶

液

不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）溶液成分 1 2 3 4 5 6 8 10 5%

水0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%丙烯酰胺溶液0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1 1.3 1.7

1.5 mol/L Tris (pH8.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 0 1.25