酶免疫测定技术
酶免疫技术
酶免疫技术（Enzyme Immunoassay，EIA）了解：1.酶免疫技术中相关技术环节2.酶免疫测定的应用理解：1.酶免疫技术的分类、测定原理及主要类型2.酶免疫技术的特点掌握：ELISA的基本原理、主要类型、方法、步骤、结果判断一、酶免疫技术概述（一）基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。
EIA：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化的专一性（二）基本特点：1.①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性2.②酶促反应专一性，保证特异性3.③底物反应放大作用，提高敏感性4.④酶标试剂保存稳定5.⑤操作简便，安全易行（三）主要试剂的制备与要求：1.酶与酶作用底物(1)用于标记酶的要求：①酶活性高②标记后酶活性稳定,不影响抗原抗体的免疫反应性③酶催化底物后信号易判定或测定④酶活性不受样品中其他成分的影响⑤酶、辅因子及底物理化性质稳定,安全无害、价廉2.酶标记抗体或抗原(1)通过化学反应或者免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。
(2)酶结合物（conjugate）：①酶免疫技术的核心组成部分②直接影响酶免疫技术的应用效果③它的制备是酶免疫技术中非常关键的一个环节①戊二醛交联法②改良过碘酸钠法（直接法）3.固相载体目的：分离游离和结合的酶标志物(1)基本要求①结合容量高，结合稳定②可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合③生物大分子固化后仍保持活性④固化方法简便易行、快捷经济(2)固相载体的种类与选择1)塑料制品（聚苯乙烯）：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用2)微颗粒（免疫磁珠）：结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析3)膜载体（western-blot）：硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA (3)包被与封闭1)包被（coating）：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程，一般采用偏碱（pH 9.6）的碳酸盐溶液2)封闭（blocking）：1％-5％牛血清白蛋白或5％-20％小牛血清，再包被以消除固相载体未覆盖位点产生的非特异干扰二、酶免疫技术的分类（一）均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。
教学课件第六章酶抑制法和免疫测定技术
1、一般了解：农药残留生物检测技术的问题和展望。 2、一般掌握：生物传感器在农药残留检测中的应用。 3、重点掌握：酶抑制技术；酶联免疫技术；生物技术
等快速测定农药残留方法等。
第六章 酶抑制法和免疫测定技术
一、酶抑制分析测定法 1、酶法概述 2、酶法检验原理 3、酶原 4、底物与显色剂 5、测定方法
（1）适用于常规方法无法测定的农药 （2）适用于环境监控 （3）适用于单一农考题
1、酶抑制法测定农药残留的基本原理是什么？ 2、免疫分析法应用于农药残留检测的关键问 题是什么？ 3、农药快速检测技术的检测原理是什么？
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3、酶联免疫吸附测定法
ELISA（Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) 原理：在测定过程中，样品提取液中的农药 与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸 附位点。（加入显色剂）
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（1）、直接ELISA原理
Ag Ag *
Ab ：Ag S
二、免疫检测技术 1、免疫反应 2、免疫分析 3、酶联免疫吸附测定 法 4、农药抗体制备 5、ELISA法的特点
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一、酶抑制分析测定法
1、酶法概述
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2、酶法检验原理
真性胆碱酯酶与胆碱能神经的生理功能极为密切。 其生理功能是，当神经冲动到达胆碱能神经末梢 时，突触小泡内的Ach外排至突触间隙，作用于 突触后膜的胆碱能受体，引起下一级神经元或效 应器的激发。在正常生理条件下，Ach完成传递 冲动作用后，随即被突触后膜上的AchE在数毫秒 内水解，生成乙酸和胆碱。
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(1)神经性毒剂对AchE的抑制机理
酶免疫技术原理
酶免疫技术原理酶免疫技术是一种常用的实验技术，其原理是将酶标记的抗体与待检测物相互作用，通过检测酶标记的反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
酶免疫技术可以用于检测抗体、蛋白质、核酸等生物分子，也可以用于定量或半定量分析。
酶免疫技术的步骤通常包括以下几个步骤：1.抗原或抗体的加样和固定将待检测物加入到试剂盒中的孔洞中，然后使其在盒子表面固定。
2.疫苗抗体的反应将已知的疫苗抗体加入到试剂盒孔洞中，使其与待检测物结合。
3.标记酶的加入将用于标记酶的物质加入到试剂盒孔洞中，使其可以与疫苗抗体结合。
4.洗涤用冷凝水或其他方式，将未结合的物质从孔洞中提取出来，以保证准确性。
5.色素反应加入染料或颜料，使得待检测物和标记酶协同反应，产生色素反应。
6.结果的读取和分析根据产生的颜色和染料的浓度，来分析待检测物的浓度和质量。
酶免疫技术通常有两种形式：1.间接ELISA间接ELISA是酶免疫技术中最常用的一种方法。
它利用酶标记的二抗与待检测物的一抗结合，通过检测酶标记反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
间接ELISA具有灵敏度高、特异性好、反应快、操作简便等特点。
2.竞争ELISA竞争ELISA是利用酶标记的抗体与水相抗原或待测物相竞争结合的一种方法。
当待测物或水相抗原与标记抗体竞争时，标记抗体附着在固定物上的数量姗姗而后，细胞内的信号会变弱或消失。
通过测定标记抗体的数量，可以计算出被测物质的含量。
酶免疫技术是一种有效的生物分析技术，其通过简单的实验流程和基于酶反应的原理，可以快速准确地检测分析生物分子的存在和浓度。
酶免疫技术在生物医学、环境科学、食品质量检测等领域有广泛的应用。
1.免疫学研究酶免疫技术在免疫学研究中有着重要的作用。
利用酶免疫技术，可以检测和定量各种免疫球蛋白、细胞因子和细胞表面标志物，研究它们在疾病状态和治疗方案中的作用。
2.临床诊断酶免疫技术在临床诊断中也有很重要的应用。
可以用于检测肿瘤标志物、气道标志物和血液蛋白等，帮助诊断癌症、哮喘和重症肌无力等疾病。
酶联免疫吸附测定与酶联免疫印迹技术
酶联免疫吸附测定与酶联免疫印迹技术1. 引言酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）和酶联免疫印迹技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称Western blot）是两种常用的免疫学实验技术。
它们在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
本文将对这两种技术进行详细介绍，并比较它们的优势和局限性。
2. 酶联免疫吸附测定（ELISA）2.1 原理ELISA是一种通过酶标记的抗体与待测物相互作用来检测目标分子的方法。
它主要包括固相吸附、特异性抗体结合、酶标记抗体结合和底物反应四个步骤。
首先，将待测物固定在微孔板上，形成固相吸附。
然后，加入特异性抗体与待测物结合。
接着，加入酶标记的二抗与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物。
最后，加入底物反应，酶催化底物反应产生可测量的信号。
根据信号的强度可以定量测定待测物的浓度。
2.2 应用ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中有广泛的应用。
它可以用于检测病原微生物、肿瘤标志物、激素、抗体等多种生物分子。
在临床诊断中，ELISA可以用于早期筛查、疾病诊断和疫苗效果评估等方面。
在研究中，ELISA可以用于分析蛋白质相互作用、药物筛选和基因表达分析等。
2.3 优势和局限性ELISA的优势在于其灵敏度高、特异性强、操作简单、结果可定量等特点。
它可以同时处理多个样本，适用于大规模实验。
此外，ELISA的结果可以通过光学密度或荧光强度来定量，结果可靠。
然而，ELISA也存在一些局限性。
首先，ELISA只能检测已知的目标分子，无法发现新的生物标志物。
其次，ELISA的结果受到固相吸附和抗体选择的影响，可能存在交叉反应和误差。
此外，ELISA对样本的处理和保存要求严格，操作不当容易导致误差。
3. 酶联免疫印迹技术（Western blot）3.1 原理Western blot是一种通过检测目标蛋白在蛋白电泳分离后的特异性抗体结合来定性和定量目标蛋白的方法。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫测定法原理
酶放大免疫测定法原理酶放大免疫测定法（Enzyme Amplified Immunoassay，EAI）是目前广泛应用于生物医学领域的一种检测方法。
它的原理是利用酶的特异性和高效性，以及免疫学技术对抗体和抗原的强烈互作用，实现对生物分子的高灵敏度检测。
在EAI中，抗体和抗原的结合将会启动与酶的结合，从而使酶的活性得到放大。
这种放大效应的实现有两个重要步骤。
首先，选择合适的抗体和抗原可以使它们在试剂盒中形成稳定的和高度特异的互作用。
其次，在酶的选择和调节方面，需要特别注重它的基本性质，如稳定性、特异性和敏感性等。
这种放大效应的实现可以通过多种不同的酶进行，常见的有辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AP）和β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase，β-Gal）等。
此外，其检测原理也分为直接和间接检测两种方式。
在直接检测中，抗体或抗原会附着在表面或载体上，当待测物与它们结合，酶便进一步识别并与待测物发生互作用。
而在间接检测中，则是通过一系列特定步骤来实现。
如首先，当待测物与表面上的抗体或抗原结合时，与其结合的二抗或二元复合体被加入到其中，酶也在其中发挥作用进行信号放大，最终通过比色法或荧光法等检测方式，对待测物进行定性或定量分析。
由于EAI具有灵敏度、特异性和多样性等方面的优势，因此在生物医学领域中具有广泛的应用前景。
其中涉及到的内容可能包括疫苗研究、细胞学研究等方面。
比如，通过对疫苗通过EAI的检测，可以反映其在人体内的免疫反应情况，有助于疾病诊断和治疗；而在细胞学研究方面，EAI还可以用于对基因表达和蛋白质分布状况等进行定量分析。
总之，EAI的原理和应用内容非常广泛，它是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，通过合适的酶放大效应，可以实现对生物分子的定性和定量检测。
酶免疫测定技术
酶免疫测定技术酶免疫测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的生物分析技术，用于检测样品中特定蛋白质或其他分子的存在和浓度。
该技术基于抗原与抗体之间的高度特异性反应，通过酶的催化作用来实现信号放大，从而实现对目标分子的灵敏检测。
一、ELISA的原理ELISA技术主要包括间接ELISA、竞争ELISA、直接ELISA和夹心ELISA等多种变种。
其中，间接ELISA是最常用的一种。
在间接ELISA中，首先将待检样品溶液加入到微孔板中，使得目标分子与固相抗体结合。
然后，通过加入与目标分子特异性结合的二抗，与固相抗体结合。
最后，加入酶标记的二抗，使其与二抗结合，形成“抗原-固相抗体-二抗-酶标记二抗”复合物。
接下来，通过加入底物，使酶催化底物发生可见的颜色反应。
最后，根据反应的颜色强度测定目标分子的浓度。
二、ELISA的应用ELISA技术具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点，因此在医学、生命科学研究、药物开发等领域得到了广泛应用。
1. 医学诊断ELISA技术在临床医学中被广泛应用于疾病的诊断和监测。
例如，ELISA技术可以用来检测人体内的病毒、细菌或其他病原体引起的感染。
通过检测患者体液中的特定抗体或病原体抗原，可以确定疾病的存在和严重程度。
2. 生物学研究ELISA技术在生物学研究中被广泛用于分析细胞因子、激素、细胞表面受体等生物分子的表达和调控。
例如，科研人员可以利用ELISA技术来测定细胞培养液中特定蛋白质的浓度，从而研究其在细胞信号传导、细胞分化和细胞凋亡等生物过程中的作用机制。
3. 药物开发ELISA技术在药物开发过程中发挥着重要的作用。
通过ELISA技术，药物研发人员可以测定药物在体内的药物浓度和药物代谢产物的浓度。
这有助于评估药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性，从而指导药物的优化设计和临床应用。
三、ELISA的优势和局限性ELISA技术具有以下优势：1. 高灵敏度：ELISA技术可以检测非常低浓度的目标分子，通常在纳克/毫升的水平上。
酶的免疫化学测定
(3)肝酶谱： 主要是用来判断有无肝实质细胞损伤、 肝内外胆汁淤积等肝胆疾病。 (4)肿瘤酶谱： 具有器官特异性的有ACP及其同工酶、 ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、 AMY及其同工酶、LPS等；非器官特异性的 有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶 等。
(5)胰酶谱：
主要用于急性胰腺炎的诊断和鉴别
2．显色染料
常用显色染料有偶氮染料和四唑盐等。它们易 溶于水，难溶于一般的有机溶剂。 酶学中只是利用所进行的偶合反应，由所生成 不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测，四唑盐起 着受氢体的作用，如将四唑盐及双四唑盐分别还原 成紫红色的甲躜(formazan)和紫蓝色的双甲躜。 常用的四唑盐有：硝基四唑蓝盐(NBT)，碘化硝 基四唑盐(INT)、甲基噻唑四唑盐(MTT)等。其中NBT 生成的色素难以溶解，在局部区域染色良好，使用 最多。
(三)临床意义
ALT是反映肝损伤的一个很灵敏的指标，临 床上主要用于肝脏疾病的诊断。 各种急性病毒性肝炎、药物或酒精中毒引起 的急性肝损害时，血清ALT水平可在临床症状(如 黄疸)出现之前就急剧升高且ALT>AST。
急性肝炎时血清ALT高低与临床病情轻重相 平行，且往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶， 是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。假如 能同时测定AST，并计算AST／ALT之比，则对于 急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也 特别有价值。急性肝炎时比值<1，肝硬化时比值 ≥2，肝癌时比值≥30． 重症肝炎时由于大量肝细胞坏死，血中ALT 逐渐下降，而胆红素却进行性升高，出现所谓 “酶胆分离”现象，常是肝坏死的前兆。
三、分析方法
临床同工酶的分析大致可分为两步，即 首先精确地分离出某酶的各同工酶组分，然 后测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的 活性。
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第九章 酶免疫技术
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。
它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。
在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。
它具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好、酶标记试剂能够较长时间保持稳定、操作简便、对环境没有污染等优点，而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）2.碱性磷酸酶（AP）3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）（三）常用的底物1.辣根过氧化物酶的底物（1）邻苯二胺（OPD）0PD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液中。
（2）四甲基联苯胺（TMB） ELISA中应用最广泛的底物。
（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）也是HRP常用的底物。
2.碱性磷酸酶（AP）的底物3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）常用对-硝基苯磷酸脂（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。
常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA一种酶联免疫技术。
用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。
即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）:是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
1•辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最咼，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%）,分子量约40000,约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
免疫学检验中的酶免疫技术
免疫学检验中的酶免疫技术20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。
这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域。
目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。
其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新。
一、常用的酶及显色底物在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1。
表1 常用酶及底二、标记物的制备在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。
制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。
标记物制备的方法基本属于两类：（一）交联法交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）（二）直接法直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。
均相酶免疫法测定原理_概述及解释说明
均相酶免疫法测定原理概述及解释说明1. 引言1.1 概述均相酶免疫法作为一种重要的实验技术，在医学诊断中具有广泛的应用。
通过使用特定酶和抗体对目标物进行检测和定量，能够提供快速、敏感和可靠的结果，因此在临床检验和科学研究中被广泛采用。
1.2 文章结构本文将详细介绍均相酶免疫法的测定原理，并讨论其优势与局限性。
同时，还将探讨在医学诊断领域中均相酶免疫法的实际应用案例，并总结其特点与优势。
最后，我们将展望均相酶免疫法未来的发展方向。
1.3 目的本文旨在帮助读者全面了解均相酶免疫法的原理及操作要点，从而提高他们对该技术在医学诊断中的应用案例的理解。
同时，通过总结其优势和局限性，为进一步改进和发展该方法提供参考依据。
2. 均相酶免疫法测定原理2.1 均相酶免疫法的基本概念均相酶免疫法是一种广泛应用于医学诊断和生物科学研究中的免疫测定方法。
其基本原理是利用酶作为信号传递体，在特定条件下，通过测量反应产物的生成来间接确定待测物质的存在或活性水平。
在均相酶免疫法中，待测物通常是抗原或抗体，而酶则被用作标记分子。
常见的酶标记剂有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶标记分子通过特异性抗体-抗原反应结合到待测物上，并形成复合物。
2.2 均相酶免疫法的工作原理均相酶免疫法主要包括三个步骤：固定、孵育和检测。
在固定步骤中，需要将待测物与特异性抗体结合，形成稳定的抗原-抗体复合物。
这一步通常通过将待测样品与标记有抗体的试剂加入反应体系中来完成。
接下来，在孵育步骤中，将上述复合物与酶标记抗体（对于待测物是抗原时）或者亚显色底物（对于待测物是抗体时）一同加入反应系统中。
在特定条件下，允许复合物和酶标记抗体或者底物发生充分的反应。
最后，在检测步骤中，通过添加染色底物以生成染色产物，并使用光谱法、比色法或荧光法等方法对产物进行测定和定量分析。
生成的信号强度与待测物的存在量呈正相关关系。
2.3 均相酶免疫法的优势与局限性均相酶免疫法具有以下几个优势：1. 灵敏度高：均相酶免疫法可以检测到非常低浓度的待测物，例如毫微克级别的蛋白质或激素。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法
肝纤维化指标的检测一直以来都是肝脏疾病的重要检测项目之一，主要包括肝纤维化指标α2-MG和ALT等，其中，酶联免疫吸附测定法（ELISA）已经成为肝纤维化指标检测的首选方法。
酶联免疫吸附测定法是一种利用特异性抗原抗体对特异宿主物质（如肿瘤酶，血清蛋白等）的特异性结合作用，再用活性抗体对特异物质的抗体进行检测，从而测定样品中某特异物质的浓度的实验技术。
酶联免疫吸附测定法的实验流程主要分为七个步骤。
摘要：
第一步：将 Elisa 的板子放在石英培养皿里，用微量移液器从管内取出特异宿主物质（如肿瘤酶，血清蛋白等），将其缓慢移液至 Elisa 板子上（有多种不同形式的Elisa 板，根据測试物质的种类和浓度来决定板子的类型），使得每个池中均有特定数量的特异宿主物质。
第二步：用抗宿主物质抗体制备样品，将样品中的宿主物质与板中的宿主物质结合，产生免疫复合物。
第三步：用抗免疫复合物抗体，将免疫复合物增强，更好地复合到抗体上。
第四步：在抗免疫复合物抗体与免疫复合物的结合上加入适量的碳酸钠溶液，将特异宿主物质从免疫复合物中沉淀出来。
第五步：在强酸性溶液中，将沉淀出来的特异宿主物质，用标准物质进行校准，以确定当前特异宿主物质的浓度。
第六步：加入酶襵显剂，将样品中的特异宿主物质評估出来，再将其与标准物质的浓度做比较，可以得出结果。
第七步：通过计算、整理得出最终结果。
总之，酶联免疫吸附测定法是一种可靠而且高效的肝纤维化指标检测方法，其简便易行的实验流程、灵敏度高和结果准确精确。
应用范围广，且常用于癌症诊断，肝纤维化活性变化诊断，以及肝纤维化指标的检测等等。
酶联免疫吸附测定各步骤的意义
酶联免疫吸附测定各步骤的意义1. 酶联免疫吸附测定的第一步呀，那可是像在黑暗中点亮一盏灯一样重要呢。
这一步通常是包被，就是把抗原或者抗体固定在微孔板上。
这就好比给小偷设下了一个个小陷阱，抗原或者抗体就像那些陷阱一样，静静地等待着目标分子的到来。
比如说，我们要检测某种病毒，就把针对这个病毒的抗体包被在板上，病毒要是在样本里，就很可能会被抓住哦。
这一步是整个检测的基础，要是没弄好，后面就全乱套啦，就像盖房子打歪了地基，房子肯定不稳呀。
2. 接下来的封闭步骤可不能小瞧喽。
这就像是给那些小陷阱做个伪装，让它们更隐蔽、更专业。
我们用一些无关的蛋白质溶液去填充微孔板上没被包被到的地方。
这就像在陷阱周围撒上一些树叶啥的，让猎物不容易发现陷阱的破绽。
打个比方，就像我们捉迷藏的时候，躲在一个角落里，然后还拿东西把自己遮一遮，这样就不容易被发现啦。
要是没有封闭好，就可能会有一些乱七八糟的东西粘到板上，干扰检测结果呢，那可就糟心了。
3. 加样这个步骤就像是一场大搜查呢。
把待测样本加进去，这时候样本里的目标分子就像一个个小嫌疑犯，要到我们之前设好的陷阱里接受检查啦。
如果是检测血液里的某种抗体，那血液样本加进去，里面的抗体要是存在，就会被包被在板上的抗原抓住。
这就好比警察在人群里找小偷，每个可疑的人都要被检查一遍，可不能放过任何一个可能的“坏蛋”哦。
4. 温育这个过程呢，有点像让嫌疑犯和陷阱充分交流的时间。
把微孔板放在合适的温度下一段时间，让抗原和抗体充分结合。
这就像两个人在互相了解一样，得给它们点时间去“聊天”，去看看是不是真的匹配。
比如说，相亲的时候，两个人也得坐下来聊一会儿，才能知道合不合适呀。
要是温育时间不够或者温度不对，就像两个人还没聊几句就被分开了，可能就错过了真正的匹配呢。
5. 洗板这个步骤超级关键，就像大扫除一样，把那些无关的东西都清扫出去。
在温育过程中，可能会有一些没有结合的物质还留在板上，这时候就要把它们洗掉。
酶增强免疫测定技术
酶增强免疫测定技术
嘿，朋友们！今天咱来聊聊酶增强免疫测定技术。
这玩意儿啊，就像是我们身体里的小侦探，能帮我们发现那些隐藏的小坏蛋呢！
你想想看，我们的身体就像一个大城堡，里面住着好多细胞居民。
有时候啊，一些坏家伙比如病菌啥的会偷偷溜进来捣乱。
那酶增强免疫测定技术呢，就是那个特别厉害的卫士，能快速又准确地找到这些坏家伙，然后发出信号告诉我们。
它可比我们肉眼厉害多啦！我们肉眼看不到的那些微小的变化，它都能察觉到。
就好像它有一双超级厉害的眼睛，能看穿一切伪装。
而且哦，这个技术特别灵敏。
哪怕只有一点点异常，它都能马上发现。
这就好比是在一大片草丛里找一根特别小的针，它一下子就能给你找出来。
那它是怎么工作的呢？其实就像是一场巧妙的游戏。
酶就像是游戏里的关键道具，它和其他的东西一起合作，就能准确地检测出我们想要知道的东西。
比如说检测某种疾病的标志物啊，这样我们就能早早知道身体有没有出问题啦。
你说这是不是很神奇？这技术就像是给我们的健康上了一道保险。
有了它，我们就能更及时地发现问题，更早地采取措施。
它在医学领域的作用可大了去了！医生们可以用它来诊断各种疾病，让治疗更有针对性。
这就好像是打仗的时候，知道了敌人的具体位置和兵力分布，那打起来不就更有把握了嘛。
咱们生活中可离不开这样的好技术啊！它让我们的健康更有保障，让我们能更安心地生活。
所以啊，大家可别小看了这酶增强免疫测定技术，它可是我们健康的大功臣呢！它默默地守护着我们，让我们能远离疾病的困扰，尽情享受生活的美好。
大家说是不是应该给它点个大大的赞呢！。
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IgM1 IgM2
Ag1
酶免疫测定技术的应用
均相法 ELISA法
均相酶免疫测定主要应用于小分子激素和半 抗原（如药物）的测定。 E M IT 方法快速灵敏、准确、专一, 适合临床 上常规检验。药物滥用、药物中毒(包括误 服与有意识服毒) , 吸毒酗酒、麻醉药成瘾， 安眠药成瘾较严重, 此外还有众多的精神病 患者, 因此各种类型的药物中毒是比较多的。 除了医疗工作需要进行治疗药物监测之外, 在急症及中毒治疗方面也要了解与掌握体 内药物或毒物的品种和浓度。本方法能够 适应上述的需要, 除用于血药浓度测定之外, 还有药物滥用与药物中毒的检测。
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梅毒的早期诊断：检测梅毒螺旋体IgM抗体（Tp－IgM）在早期梅毒诊断中有 重要的意义。采用ELISA法，进行血清/ 脑脊液的梅毒螺旋体IgM抗体的检测。 在献血员中梅毒螺旋体抗体的筛查中也常用此法，有利于控制和减少梅毒的 输血传播。 定量检测内毒素： 临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达 20％－30％，检测标本中的LPS 对早期诊断和防治有重要意义。 食品中有害成分残留的测定 检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶（HRP）标记高亲和力的黄曲霉毒素 Ｂ1 (AFTB1 )抗体，建立了直接竞争抑制ELISA 快速筛选法。大大缩短了检 测时间。 一些蛋白质即使经过了加工处理，也是一种潜在的过敏原，会让某些人产生 过敏反应。采用多克隆抗体间接竞争ELISA 法和抗体夹心ELISA 法，可测定 食品中的痕量花生蛋白和榛子蛋白。组胺既是鱼类食物中毒的主要原因，也 是“奶酪综合症”的病因。 测食品中的残留农药：迄今为止，应用ELISA检测食品中的残留农药主要是除 草剂、杀菌剂和杀虫剂。ELISA 法测定农药残留以其特异性强、灵敏度高及 快速准确而得到广泛的应用，尤其是现场控制水果、蔬菜、食品中的农药残 留，对发展无污染农产品，保障人体健康起到积极作用。 检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。 检测食品中其它成分：植物雌激素在植物中含量很低， 但它能帮助治疗一些 疾病。用ELISA 分析植物雌激素。牡蛎蛋白是牡蛎精粉的主要活性成分，可 采用斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)测定牡蛎蛋白的含量。另外，ELISA也 可以用来检测食品加工过程中的酶 (如磷酸丙糖异构酶、转谷氨酰胺酶 )含 量的变化。
酶免疫测定技术
组员：丁鑫鑫 刘璐 顾芯铭
何为酶免疫测定？
enzyme immunoassay,EIA
抗原抗体反应的特异性
+
酶催化反应的高效性
酶免疫增强测定技术EMIT 均相酶免疫测定
酶免疫测定技术
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定 异相酶免疫测定 固相酶免疫测定 ELISA
酶免疫增强技术EMIT
• ELISA的应用存在的问题 ELISA应用于检测抗原、抗体及半抗原，在实际 应用中可作疾病临床诊断与监察、食品中有害成 分残留的测定、与基因工程合并使用等，但在 ELISA的应用中也存在一些问题，例如：其特异 性取决于抗原的制备，试剂半衰期长，这ELISA 的应用带来了很大的局限性，实际研究工作中应 克服这些点，为ELISA的应用提供更为广阔的应 用与发展空间.
• 一、治疗药物监测一药物血浓度测定 • 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、 N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 • 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 • 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可 以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 • 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 • 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 • 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 • 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 • 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。测 定方法亦系以阴性、低、中等三种浓度的标准品作对照比 较, 以测算样本中存在的药物量。
ELISA法
• 酶 联 免 疫 吸 附 法（ ELISA）是1971 年由Engvall 等建立的一种生物活性物质微量测定新技术，以其灵敏度 高，特异性好等优点，在生命科学各领域得到广泛应用， 它已迈出医药、临床领域，步入农业、渔业、畜牧业和食 品加工业。 • 常规的 ELISA 测定法有：间接法、双抗体夹心法和抗原 竞争法。在实际应用过程中，该技术常不断改进，形成了 多种分析方法，并且在检测的灵敏度、特异性、操作简单 化以及实时、高效等方面都有很大提高，可以说ELISA 是 当前应用最广、发展最快的一项微量测定技术。 • ELISA原则上用于检测抗原、抗体及半抗原，在实际应用 中可作疾病临床诊断与监察、食品中有害成分残留的测定、 与基因工程合并使用等，为保障人类健康发挥着巨大的医 学与遗传学作用。
捕获法
• 此法用于血清中某种抗体亚型成分测定。以 IgM测定为例：
样本 抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体 （IgM1、2） 抗人IgMμ链抗体 IgM1
抗人IgMμ链抗体
IgM2
特异抗原（Ag1） 抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体 IgM1 IgM2 Ag1 Ab1*E Ab1*E
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
• 此法是测定抗体最常用的方法。
异相酶免疫测定类型
• • • • • 根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
竟争法
• 此法可用于抗原和半抗原的定量测定， 也可用于测定抗体。
异相酶免疫测定类型
• • • • • 根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
• 医学临床中的应用
• 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提 供了特异性，敏感性强的试验基础。 • ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。 • ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。 • 乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的 抗原或抗体，一直受到高度重视。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检 测方法， 绝大多数都是ELISA 法。80％ 原发性肝细胞癌患者的， 血 清甲胎蛋白（AFP）含量增高。临床借助对AFP的检测作为对原发性 肝细胞癌的辅助诊断。 • HIV 抗体初筛：抗体测定必须区分初筛和确认两个步骤, 目前常用的 初筛实验方法为第3 代ELISA试剂, 其敏感性和特异性均可达99%以上。 现已发展到抗原加抗体联合检测第四代试剂, 包被和标记的分别是 HIV1/2 O 抗原和HIV- l P 2 4 抗原的单克隆抗体, 可同时检测HIV抗原 和抗体, 检出时间提前大约七天。
• • • • • 根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
双抗体夹心法
• 此法常用于测定抗原，适用于多价大分 子抗原的检测，而不能用于测定半抗原 等小分子物质。
异相酶免疫测定类型
• • • • • 根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹CEDIA
均相酶免疫测定
• 测定快速、准确、专一、灵敏 • 试剂稳定
• 操作过程简便 • 数据处理简单
酶免疫增强测定技术EMIT 均相酶免疫测定
酶免疫测定技术
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定 异相酶免疫测定 固相酶免疫测定 ELISA
酶免疫增强技术EMIT
异相酶免疫测定类型