蛋白质组学

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Redefining Accurate Mass
Ultimate Performance
Exceptional coverage
Finnigan LTQ Orbitrap
Finity MSn
按定量方式
相对定量
绝对定量
按标记方法
标记法
•体内标记法（SILAC）
•体外标记法(ICAT、ITRAQ、AQUA、18O) 无标记法 •信号强度法 •谱图计数法
SILAC原理流程
ICAT原理
无标签标记
蛋白质组学各种定量方法的比较
蛋白质的鉴定方法
► 鉴定蛋白质的方法
质量纹鉴定法（Peptide Mass Fingerprinting） 二级质谱的数据库搜索鉴定法（MS/MS Database Searching）
Proteolytic digestion
Sample
Electrophoresis
Pure protein MALDI-TOF
Proteolytic fragments Capillary Electrophoresis HPLC
Mass spectrum
GCG
Amino Database
acid
通常采用以下两种策略实现定量
在蛋白水平的定量策略：将蛋白复合物进行二 维凝胶电泳，比较蛋白在凝胶上染色的深度进行 相对定量，再对差异蛋白进行质谱分析定性。 在肽段水平上的定量策略：此类方法通常需引 入一种稳定同位素(13C、3H或5N)标记的基团．不 向的蛋白混合物被酶 ( 如胰酶 ) 水解成肽段，来源 于其中一种蛋白混合物的肽段被轻同位素 (12C 、 2H或4N)基团标记，而另一来源的肽段被重同位素 基团标记，通过同位素区分肽段在质谱中所形成 的峰高和面积或者报告离子的峰高和面积，对不 同样品间的相同蛋白质进行定量。
2001 年4 月，在美国成立了国际人类蛋白 质 组 研 究 组 织 （ Human Proteome Organization, HUPO）。
美国国立癌症研究院（NCI）投资1 000万 美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白 质组数据库。 NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不 同阶段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成 或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白 质组研究。
四极离子阱分析器
四极离子阱是由一对环形电极和两个呈双曲面形的端盖电极组成的，在环形 电极上加射频电压或再加直流电压，上下两个端盖电极接地。离子阱的射频 电场决定了离子在X、y轴方向的运动，而端盖电极决定了离子在Z轴方向的 运动。通过电场的变换，离子按照m/z值递增的顺序从离子阱进入检测器， 即利用离子飞行轨道的不稳定性来选择特定质荷比的离子。
►1997 年召开了第一次国际“蛋白质组学” 会议 ►1998 年在美国旧金山召开了第二届国际 蛋白质组学会议 ►1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质 组会议 ►……
►我国也于1998年启动了蛋白质组学研究， 在中科院上海生物化学研究所举办了两 次全国性的蛋白质组学研讨会 。 ►2001 年，中科院贺福初院士作为首席科 学家，在全国范围内组织起一支研究队伍， 提出了“人类重大疾病的蛋白质组学研 究” 973 建议书并通过评审，并确立了 9 个相关课题组。
►
2. 双向凝胶电泳（2-DE）原理
先根据蛋白质的等电点不同在pH梯度介质 中进行第一次分离，即等电聚焦（isoelectric focusing, IEF），然后根据蛋白质分子量的不 同进行第二次分离，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳。 完整的实验步骤包括：
样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、
染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定
离子回旋共振分析
离子在离子回旋共振分析仪中以某一特定的频率做回旋运动，并因此产生 能被离子回旋共振分析仪的离子阱中检测板(电极)检测到的电流(镜像电流)。 由于离子回旋频率与 m/z是成反比的，被记录下来的信号时间间隔被转换 为频率(傅立叶转换，PT)，最终计算得到m/z。
► Single
quadrupole 单四极杆 ► Triple quadrupole 三级四极杆 ► Ion trap 离子阱 ► TOF 飞行时间 ► Orbitrap ► FTICR ► Q-TOF ► TOF-TOF ► Q-trap ► Ion trap-TOF ► LTQ-Orbitrap ► LTQ-FT ►…
Nsequencing LC/MS/MS
searching
蛋白质组研究的支柱：
双向电泳技术
生物质谱 生物信息学
双向电泳技术
1.双向电泳技术发展史（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）
►
O‘Farrell 1975年创建高分辨率的双向凝胶电泳，对大肠杆 菌细胞抽提物双向电泳，分离到1100个蛋白组分。但载体 两性电解质使得pH不稳定且重复性差。
四极杆分析器
由相对的两个电极组成一对组成，其中一对带有射频电压(RF)和直流电压 (DC)，另一对杆有极性相反的电压。四极杆滤质器通过离子飞行的稳定性 来选择特定质荷比的离子：通过变换RF幅度和DC电势，四极杆滤质器仅赋 予特定m/z值的离子稳定的飞行轨道来通过滤质器并到达检测器，而其他 m/z值离子则因为不具备稳定飞行轨道而被滤质器清除。
科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和
“ 863” 计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质
组研究”列为重点项目。
目前，我国已在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研
究方面取得了较大的进展
►2003年12月15日，国际人类蛋白质组计划(HPP) 正式启动 。首先开始执行人类血浆蛋白质组计划 (HPPP)和人类肝脏蛋白质组计划(HLPP)两大先导 项目。其中人类肝脏蛋白质组计划总部设在北京， 由中国担当领导国，由中国科学家领衔组织。领衔 专家是中科院院士贺福初教授。 ►两谱三图三库 ：“两谱”即人类肝脏蛋白质组的表 达谱和修饰谱，“三图”是指人类肝脏蛋白质组的 定位图、连锁图和结构图，“三库”即为人类肝脏 蛋白质组的样本库、抗体库和数据库。
2003 成立了中国人类蛋白质组组织（ CHHUPO ），并分 别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国 蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会， 2004 年 10 月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。 2013年9月7-10日，第八届中国蛋白质组学大会在重庆国 际会议展览中心召开。本次大会的主题是“人类蛋白质组 计划：让人类更健康”，并决定第九届中国蛋白质组学大 会将于2015年在厦门召开。
结构基因组学→功能基因组学 蛋白质组学是核心内容
进 展
各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：
1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白 质 组 研 究 中 心 （ Australia Proteome Analysis Facility ， APAF ），丹麦、加拿 大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。
生物信息学
因特网上的数据库和工具
NCBI UniProt
Swiss-Prot
KEGG Reactome
质谱数据库检索软件
Sequest
Mascot: Sonar, GutenTag, OLAV, ProbID, ……
定量蛋白质组学
2014年06月10日“中国人类蛋白质组 计划（CNHPP）” 全面启动实施。这 是中国科学界乃至世界生命科学领域一 件具有里程碑意义的大事。
蛋白质组学研究技术
蛋白质组研究的策略：平台与整合
动物模型/细胞 人类疾病
功 能 分 析
蛋白质组研究
生物信息学分析
蛋白质组新技术
蛋白质组研究的基本技术路线
生物质谱（mass spectrometry）技术
►
原理：样品离子化后，根据离子质荷比的不同进行分离并 确定分子量，具有灵敏度高准确度高易于实现自动化等优 点。 在80年代早期出现了两种新的离子化技术，使质谱从仅能 分析小分子挥发物到可以研究生物大分子。
*基质辅助激光解析离子化（MALDI） *电喷雾离子化（ESI） *2012年的化学诺贝尔奖
Genpept示例
►
这些技术能非常快速和准确的测定大分子物质，结合 各种质谱技术后，可以在各种水平上研究蛋白质，为蛋白 质的研究开辟新道路。
质谱仪的分类
飞行时间分析器
四极杆分析器 四极离子阱分析器 离子回旋共振分析 …….
飞行时间分析器
离子化的分了首先从加速电压获得预定量的动能，此动能为Uz，其中U指加速电压， z指电荷。由此可知离子的运动速度是v＝(2Uz/m)1/2，在U—定的情况下，由m/z决 定其速度，这里m指离子分子的质量。换而言之，在同一距离中，低m/z的离子将 比高m/z的离子运动得快。
蛋白质组学
蛋白质组学的概念及发展史
一、蛋白质组学的概念
蛋白质组（proteome）是澳大利亚学者 Williams 和 Wilkins 于 1994 年首先提出， 源 于 蛋 白 质 （ protein ） 与 基 因 组 （ genome ）两个词的杂合 , 即“一个 细胞或一个组织基因组所表达的全部 蛋白质”。
► 定量蛋白质组学（Quantitative
Proteomics）是
对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混 合体系内所有蛋白质进行精确鉴定和定量。
► 定量蛋白质组学可用于筛选和寻找任何因素引
起的样本之间的差异表达蛋白，结合生物信息 学揭示细胞生理病理功能，同时也可对某些关 键蛋白进行定性和定量分析。
Sample MS Spectrum
蛋白序列数据库
► 在美国国家生物信息中心的网站
上可以查询到最新的 蛋白序列数据库。 ► NCBI上的数据库中，信息最丰富的是 Genpept格式，包括有蛋白的序列，各种性 质，甚至于参考文献。 ► 蛋白序列的信息。
修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联 系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
主要研究内容
► 蛋白质组表达模式的研究
：了解不同状 态下细胞与组织的蛋白质组分的变化 ：明确各种蛋 白质分子之间如何相互作用；
► 蛋白质组功能模式的研究
二、蛋白质组学的产生与发展
背景

基因组时代 →后基因组时代

研究重点的转移
多肽质量纹鉴定
► 多肽质量纹（Peptide
Mass Fingerprinting， PMF）是从一级质谱（MS ）中鉴定多肽的主 要方法。 ► 多肽质量纹一般都是在 MALDI-TOF 仪器的结 果上进行。 ► 其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽 质量的信息。
一级质谱图
► 蛋白质经过酶解后，送入质谱仪，得到一级
质谱。 ► 目前来说，由 MALDI-TOF 质谱仪产生的质谱 图精度较高，而由ESI质谱仪产生的质谱图精 度相对较低。 ► 另一个问题是，ESI产生的质谱图中的离子通 常带有很多电荷，而 MALDI 质谱图中的离子 一般只带一个电荷，比较容易计算。 ► 所以从一级质谱鉴定蛋白质的算法（质量纹） 主要用在MALDI-TOF产生的质谱图上。
蛋白质组的含义
►对应于基因组的所有蛋白质构成的整
体，不是局限于一个或几个蛋白质。
►在不同细胞、不同组织中，同一基因
组的表达情况各不相同 。
►在空间和时间上动态变化着的整体。
蛋白质组学(proteomics)
指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门
新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞
内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与
►
1982年Bjellqvist 等引入固相pH梯度IPG（Immobilized pH
gradients)。解决了双向电泳重复性差、阴极漂移、可比性差
上样量低等一系列问题。
►
1994年，Rabilloud 等用胶内水化的方法进行双向电泳，
进一步增加了样品上样量。 1998年，Islam等 IPGphor等电聚焦系统的引入大大简化 了IPG－IEF，聚焦水化同时进行。