精氨酸激酶(AK)

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化
报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣
班级学号0801/2008114010130
指导教师汪劲松
完成时间2011年5月
生物学实验教学中心
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引言.. (2)
1 实验材料 (2)
2 实验方法 (3)
2.1菌种活化 (3)
2.2扩大培养 (3)
2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)
2.4 AK的提取及其纯化 (3)
2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)
2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)
3 结果与分析 (4)
3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)
3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)
总结 (6)
参考资料 (7)
藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化
余姣
（指导老师：汪劲松）
摘要：
精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。

本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。

当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。

接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。

采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。

关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化
余姣
（指导老师：汪劲松）
引言：
蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。

目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。

为学习和掌握蛋白质的提取方法，对精氨酸激酶进行提取及其鉴定。

无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP 上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。

1 实验材料与仪器
卡那青霉素：100mg/mL。

LB培养基：10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，加水调至1L，新配制的并用新配制的NaCl、Hcl调节PH至7.0。

分装后高压蒸汽灭菌。

IPTG诱导液：400mg/mL。

裂解液: 主要成分为Tris，NaCl，EDTA。

Stripping buffer：10mL EDTA，20mM Tris base, pH=8.0, 加蒸馏水调至1升。

Binding buffer: 100mM Nacl, 20mM Tris base, pH=8.0, 加蒸馏水调至1升。

含配基咪唑的洗脱液：梯度为50 mM和200mM
处理液主要成分：溴酚蓝指示剂，SDS变性剂。

考马斯亮蓝R-250染色液：50mL甲醇+10mL乙醇+40mL蒸馏水+0.25g考马斯亮蓝。

12%的分离胶5mL：Tris-cl pH8.8 1.3mL, 30%丙烯酰胺2mL, 10%SDS 0.05mL, 10%过硫酸铵0.05mL, H2O 1.6mL, TEMED光催化剂0.002mL。

(这些药品都需按顺序加入柱子中，最后加水使水与胶之间的界面保持在一条平行线上。

）
12%的浓缩胶2mL：Tris-cl pH6.8 0.25mL, 30%丙烯酰胺0.33mL,10%SDS 0.02mL, 10%过硫酸铵0.02mL, H2O 1.4mL, TEMED光催化剂0.003mL。

分离胶
仪器：紫外分光光度计U－4300，电脑恒温层析柜、ORION pH计、
紫外检测仪、冷冻离心机、超声破壁仪、雪山制冰机、
超纯水机、低温恒温槽电泳仪、电子天平、振荡培养箱、
单人单面净化工作台、电热恒温鼓风干燥箱、高压灭菌锅
2 实验方法
2.1菌种活化
取100 µL表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/mL）中，于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。

2.2扩大培养
将试管中活化的菌液6mL接种到100 mL LB培养基，同时加入卡那青霉素（终浓度50 µg/mL）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3 小时。

2.3 IPTG诱导AK的表达
实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当温度为22 ℃，OD=0.6-0.8时，IPTG终浓度为0.5 mM时AK的表达量达到最大。

2.4 AK的提取及纯化
蛋白质的提取
（1）将上述各管于4 ℃，5000 r/m离心10分钟；
（2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g 沉淀加5 mL裂解液；
（3）在冰上进行10分钟，间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止；
（4）于4 ℃，12000 rpm，离心10分钟，取上清，得到AK的粗提液。

2.5 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白
His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个NTA氮基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni离子与目标蛋白的6xHis之间会产生吸引力，从而上样即粗提液流经柱子时，带有His-tag标记的AK被吸附在柱子上而与其他杂蛋白区分开来。

AK的纯化：
预处理:依次用Stripping buffer（20min）蒸馏水（30min）；0.5MNaOH(1h)、Binding buffer （20min）、蒸馏水（30min）；1MNaCl（1h）、Binding buffer（20min）蒸馏水（30min）；150mL0.1MNiSO4洗树脂柱子使Ni柱再生，最后用蒸馏水洗至穿流物为无色。

平衡：6倍柱床体积Binding Buffer(pH=8.0)平衡。

上样：插A280滤光片，调A值（1）、T值（100）；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。

将粗提液45 mL上柱，流速约为1.6-1.8mL/min。

洗脱：上样完后，继续用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗。

待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（50 mM、200 mM）洗脱。

在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。

分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。

2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳：
（1）安装双垂直板电泳槽；
（2）配12%的分离胶5mL，浓缩胶2mL；
（3）制样：分别取原样AK粗提取液、未挂上柱的样品即穿流物、收集的目标蛋白（共3个管）40 µL与样品缓冲液10 µL混合，加入EP管并分别做上记号，用封口膜封口，泡沫塑料固定，于100 ℃热水中加热5分钟；
（4）上样：用微量注射器加样15-20 µL
（5）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；
（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；
（7）脱色并扫描电泳图：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色后扫描电泳图。

3 结果与分析
3.1提取物的层析图谱与分析
分析：如图1所示，图中共出现了3个波峰，第一个波峰是AK粗提取液上样后经Binding buffer洗脱而将未挂在柱子上的杂蛋白洗脱下来了；第二个波峰显示的是用较低浓度为50 mM的咪唑洗脱液流经柱子竞争性结合连接在柱子上的AK，从而将其洗脱下来；第三个波峰显示的是用高浓度的为200 mM的咪唑洗脱液流经柱子将那些结合比较紧的AK洗脱下来。

我们还可以发现后两个波峰较第一个低，这说明杂蛋白的含量较AK的多，故280nm处的吸收值高些。

3.2提取物SDS-PAGE电泳图与分析
1 2 3 4 5
注：泳道1：原液;泳道2：穿流液;泳道3:10mM咪唑洗脱液；泳道4:10mM-250mM咪唑洗脱液; 泳道5:250mM咪唑洗脱液（AK）
分析：有电泳图谱可知在250mM咪唑洗脱液洗脱时AK的收集效果做好，由10mM-250mM 咪唑洗脱液洗脱时洗脱液的浓度越高AK收集的越多。

2—7管在同一水平线上且只有一条带说明该AK只由一条多肽链组成。

总结
虽然身心疲惫但感到前所未有的高兴；虽然错误百出但有丰富的收获。

对于研究生的生活似乎有了一点点的理解。

作为实验者在做实验前就需要对整个项目的目的、实验过程、所需材料药品用非常了解，主要有以下这些：
（1）实验仪器要严格按照说明书使用，尤其是第一次使用的、精密仪器使用时务必得小心。

（2）扩大培养时应当多做3-4个培养基，以防止某个实验组的培养基有问题，尽量考虑到备用组。

（3）药品的配置应当比实验所需的量适量多些，考虑到必要的损失，但也不可太多
而造成药品的浪费。

（4）实验一定要考虑到每一步大约所需的时间、下一步所要做的是什么和应该怎样做才更科学，不可糊糊涂涂到时候不知如何下手。

（5）不管实验中途出现什么问题都要静下心来坚持做下去，然后根据实验条件和问题分析问题原因。

总结实验得失，为以后的实验打下基础。

改进与期望
1．实验中我们用到了超声波破壁技术，以获取E.coli表达释放到胞质中的AK。

由
此我们可以想到释放到细胞外的分泌蛋白，只需离心或过滤就可以分离分泌蛋白和细胞。

那么我们能不能将AK基因与E.coli内的某一基因融合而使AK分泌表达呢？据了解，科学工作者们已经在构建重组蛋白生产系统，使外源蛋白能够分泌到细胞外做了很多努力，但效果不怎么好。

所以重组蛋白细胞外分泌是人们所研究的目标。

2．实验中我们可以用阿拉伯糖操纵子+AK基因的重组质粒代替用诱导剂IPTG诱
导lac操纵子+AK的重组基因的表达。

我们知道IPTG有毒，且诱导效果较高时需要高温，然而本实验受菌种生长温度以及AK活力温度的影响，将温度设为37度，所以效果较差。

因此用Ara操纵子效率更高。

3．在检测AK时我们可以在加样孔中加入已知分子质量蛋白质的混合物，这样我
们可以通过以已知分子量蛋白在胶中迁移的距离L为纵坐标，以分子量对数lgMr为纵坐标作图，会得到lgMr与L的线性关系，将AK移动的距离代入公式就可大概求出AK 的相对分子质量。

最后，感谢老师在本实验中的细心指导和同学的帮助！
参考资料
1.《蛋白质分子生物化学与生物技术》【爱尔兰】G.沃尔什著化学工业出版社。

2.《生物化学》（第三版）王境岩朱圣庚徐长法主编高等教育出版社。

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