03_精氨酸激酶(AK)的提取与纯化
精氨酸激酶(AK)的提取与纯化
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。
再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。
精氨酸酯酶的分离与纯化
进行 皮下注射 ，４ｈ后将 小 白鼠处死 ， 去其 背部 的皮， ２ 剥 观
察 皮 上 出血 斑 情 况 。 ２５ 精 氨 酸 酯 酶 的 粗 提 【 二 乙 氨 基 乙基 葡 聚 糖 Ａ ５ ． 】 一Ｏ （ Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｅＡ ５ ） 层 析 洗 脱 液 在 紫 外 仪 器 ２ ０ ｔ Ｄ Ａ —ｅｈ ｄｘ －０ 柱 ８ ｉ ｍ
牛血清白蛋白（ 中科院上海生物物理所 生化厂 ） 。
２ 方法与结果 ２ １ 酶 活 力 测 定 【 以 Ｔ ． １ 】 ＡＭＥ为 底 物 ， 不 同 含 量 待 测 加
酶 液 ， ５ ０ｎ 处 测 光 密 度 。 在 ０ ｍ
２ ２ 蛋 白含 量 测 定 ． Ｆ ｌｎ酚 法 【 标 准 牛 血 清 白 蛋 白 稀 ｏｉ ｌ一 】
志 ，９ ５ １ （ ） ｉ一２ １９ ， ５ ３ ：ｏ１ ．
师范大学学报 （ 自然科学版）２ ０ ，７ ４ ：７８ ． ，０ ０ ３ （ ）７ —１ ［ ］ 中华人 民共 和 国 药 典． 部 Ｉ ］ 北 京： ４ 一 ｓ． 化学 工业 出版 社，
２ ０ ２ ７． ０ ５： ７
［ ］ 孔 婕 ， 健 ， 文 燕 ， ． 翘 挥 发 油 化 学 成分 的研 究 ［ ］西 北 ３ 姚 达 等 连 Ｊ．
一
定 神 经 毒 和 出 血 毒 ， 须进 行 再 次 纯 化 。此 方 法 重 复 操 必
作， ３ 得 批结果相近 的样 品， 将每次分得 的峰 Ⅳ冷冻干燥待
用。
１ 仪 器与材料
（） 器 ： Ｚ ０ —２型 紫 外 分 光 光 度 计 、＂ １仪 ＷＦ ８ ０１ ３ ＂ ２型 光 栅 Ｉ ２ 分 光 光 度 计 、 Ｇ３型 多 用 泳 干 燥 机 ；２ 药 品 和 试 剂 ： 白 Ｌ 一 （） 长 山 蝮 蛇 蛇 毒 （ 源 县 ） ＤＥ Ｅ Ｓｐ ａｅＡ一０ Ｓ Ｅ Ｅ 清 、 Ａ —ｅ ｈｄｘ ５ Ｗ Ｄ Ｎ Ｐ Ｒ ＨＡ ＭＡＣＡ 产 品 、 Ａ （ Ｉ Ｔ ＭＥ 中科 院 上 海 生 物 化 学研 究 所 ） 、
精氨酸酯酶的分离和纯化
１ ． ５抑 菌作用 比较方法 将 实验 用 肠 炎沙 门氏菌接 种 于ＭＨ肉汤 中 ，体 积 约为 ３ ｍＬ，在 ３ ７ ￣ Ｃ 环境 下培养 ｌ ８ ｈ ，并将菌液稀释 到浊度 １ ０ ５ Ｃ Ｆ Ｕ ／ ｍ Ｌ ，然后使用二 倍 稀释法进行提取物 的体外抑菌实验 ，每个浓度 的实验均 重复３ 次。
酸性 氨基 酸及辅 氨 酸。蝮 蛇 中的 类凝血 酶 属胰蛋 白酶 家族 ，通过 切 除血 纤维蛋 白原的凝 聚 ，起凝 血作 用 ，但在体 内因它 不会 激活凝 血 因子
ｘ Ⅲ，所 以 由其 水解 产生 的纤 维蛋 白凝 块 的侧 链 不 能交联 ， 易被 纤 维蛋 白溶 酯降解 ，导致 体 内纤 维蛋 白浓度 下 降而表现 出抗 凝 效应 。
以Ｔ Ａ ＭＥ 为底 物 ，比较不 同含 量待测 酶液条件 下 ，在 ５ ０ ０ ｎ ｍ 处 测 光密度值 并记 录。见表１ 。
表 １ 酶 活 力 测 定
１材 料与仪 器 １ ． １实验材料 药 品和试 剂 ：长白山蝮蛇 蛇毒 、Ｄ Ｅ ＡＥ ． Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ａ ． ５ ０ Ｓ ＷＥ Ｄ Ｅ Ｎ
＜０ ． ０ ５ ，表 １ ）。
传统 的黄芩苷提取 方法 为水煮法 ，但水煮法 的提 取时间 比较长 ， 而 且提取率 比较 低。因此 ，为 了提 高黄芩苷的提 取率 ，笔者采 用最新 的超声提 取法 和传统 的水煮法进 行对 比分 析 ３ ］ 。研究结 果显示 ，超 声 法 提取黄芩 的抑 菌效果 明显优 于水煮法提取 的黄芩 ，超声法提 取黄芩 结晶物的抑菌效果明显优于水 煮法提取 的黄芩。 综上 所述 ，黄芩具 有 良好 的抑 菌作用 ，并且 使用超声法进 行有效
AKP提取
操作步骤：
1.匀浆：取家兔的肝脏约2克，加入 0.01M醋酸镁-错酸钠混合物匀浆，记 录体积，取0.1ml于ep管中（A液）。
2. 提取：加2ml正丁醇于匀浆液中， 室温静置30min，过滤.
3.丙酮沉淀：加入等体积丙酮，混匀 离心，沉淀用4ml醋酸镁溶解，记录体 积，取0.1ml于ep管中（B液）。
生物大分子的分离纯化
分离纯化的一般程序
▪ 生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个 阶段： ①材料的选择和预处理 ②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器 的分离） ③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离
▪ 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前 处理。
一、材料的选择与预处理
• 选择材料 含量高、来源丰富、易获得
➢等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电 斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白 质的等电点有差别，可利用调节溶液的 pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀
➢低温有机溶剂沉淀法
ห้องสมุดไป่ตู้
有机溶剂沉淀法的优缺点：
优点
1.分辨能力比盐析高，即一种蛋白质或其 他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范 围内沉淀 2.沉淀不用脱盐
缺点 比Folin-酚法灵敏度低
Folin-酚法
原理
Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。在 Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件 下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫 色络合物（类似双缩脲反应）。
由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物 在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、 溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅 与蛋白质含量成正比。
缺点
对某些具有生物活性的大分子容易引起变 性失活，操作需在低温下进行。
生物化学实验PPT课件：精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定
四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀 根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱 用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先 在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开 柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。 酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液， 立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时 停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一 个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
• 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? • 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ • 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ • 4. 如何确定目的蛋白？ • 5. 如何评价蛋白质纯度？ • 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白
质 含量和活性？
精氨酸激酶的提取、 分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料、仪器和试剂 • 实验操作步骤 • 仪器使用 • 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离 纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的 蛋白质的确定方法。
二、原理
凝胶过滤(Gel Fitration Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是 混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离 的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间 的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶 颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质 可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到 分离的目的。
精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究_1[1].1精氨酸激酶_11_15
![精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究_1[1].1精氨酸激酶_11_15](https://img.taocdn.com/s3/m/39d0317101f69e31433294dd.png)
第一章引言１．１ 精氨酸激酶 精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物的激酶。
它的作用是催化如下可逆反应：将ATP上的磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能键的储能分子――磷酸精氨酸。
反应方程式如下：精氨酸＋ATP・磷酸精氨酸＋ADP・Mg + H+AK被发现已经超过70年的历史了, 它属于磷酸原（胍基化合物）激酶这个大家族中的一员。
现在已经在许多种无脊椎动物中发现了AK, 例如有鳌节肢动物(chelicerate arthropod) Limulus polyphemus[1], 腹足动物(gastropod) Cellana grata 和Aplysia kurodai [2]，海参Stichopus japonicus[3]，头足类动物Nautilus pompilius[4]，龙虾(lobster) Homarus vulgaris[5]，海葵（sea anemone）Anthopleura japonicus[6]，海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus[7]等无脊椎动物中都已经分离得到了AK。
尽管说基本功能都是催化同样的高能磷酸键转移反应，但是从不同的无脊椎动物体内得到的AK的结构和分子量大小却存在着很大的差异。
这些不同的精氨酸激酶结构和大小有以下类别：（1）单亚基，如海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus 的AK[7]，是一种相对分子量约为40 kDa的单亚基的蛋白质。
单亚基的AK是目前研究最多的一种AK。
本论文中用到的AK就是单亚基，相对分子量约为40 kDa。
（2）双亚基，如海参Stichopus japonicus中分离得到的AK就是一种相对分子量约为84 kDa的双亚基蛋白质[3]。
（3）四个亚基，如环节动物（annelid）Sabella pavonina中具有相对分子量在150～160 kDa之间的四亚基AK[8]。
精氨酸激酶(AK)
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。
引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。
本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。
当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。
接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。
采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。
关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。
目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。
氨基酸的分离纯化技术
氨基酸的分离纯化技术化学与材料科学学院2008级*** ***摘要:氨基酸是一种重要的生物化工产品,它广泛应用于食品、化妆品、饲料添加剂以及医药等领域。
在氨基酸的工业生产中,其分离及纯化是的一个重要环节,在总投资费用中占有很大比例。
本文对目前我国工业上常用的氨基酸分离提取方法的研究进展状况作了较全面的总结。
关键词:氨基酸;分离;纯化1 引言氨基酸是组成蛋白质的基本单元,是生物有机体的重要组成部分,具有极其重要的生理功能。
氨基酸广泛应用于食品、饲料添加剂及医药领域,也被用作合成特殊化学物质的中间体,如低热质甜味剂、螯合剂及多肽。
目前,多数氨基酸采用发酵法生产,与氨基酸发酵等生产技术的发展相比,其分离与纯化的成本可占总成本的50%以上,故提高氨基酸分离的选择性和产率及对分离纯化新技术的研究有着极其重要的现实意义。
2 氨基酸的性质氨基酸是一种具有两性官能团的物质。
氨基酸分子既含有氨基又含有羧基,氨基和羧基的电离取决于溶液的pH值和氨基酸的等电点pI:在pH低于等电点pI 时,羧基的电离被抑制,氨基酸带正电荷;在pH值高于等电点pI时,氨基的电离被抑制而带负电荷;在等电点时,氨基酸的溶解度最小,最易从溶液中析出。
按照侧链基团的不同,氨基酸可以分为3类:酸性氨基酸,中性氨基酸,和碱性氨基酸。
而各种氨基酸的等电点不同,(酸性氨基酸<中性氨基酸<碱性氨基酸)。
利用这个性质,可以把它们进行分离纯化。
3氨基酸的分离与纯化几乎所有的氨基酸分离纯化工艺均利用了氨基酸在不同的pH值时电荷量不同这一特性。
氨基酸的分离纯化方法主要有:沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、膜分离法及结晶法等。
3.1 沉淀法沉淀法是最古老的分离、纯化方法,目前仍广泛应用在工业上和实验室中。
它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。
该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法,特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
l—精氨酸的提取纯化流程注意事项
l—精氨酸的提取纯化流程注意事项英文回答：Extraction and Purification of L-Arginine: Considerations.L-arginine is a semi-essential amino acid that plays a crucial role in numerous physiological processes, including protein synthesis, nitric oxide production, and immune function. Its extraction and purification from natural sources or fermentation broths require careful attention to specific considerations to ensure high yield and purity.1. Raw Material Selection:Choose high-quality raw materials with low levels of impurities and contaminants.Consider the specific source (e.g., plant, animal, microbial fermentation) based on availability, cost, anddesired characteristics.2. Extraction Method:Select an appropriate extraction method based on the solubility and stability of L-arginine in various solvents. Common methods include:Water extraction: Suitable for extracting L-arginine from plant sources.Acid hydrolysis: Breaks down proteins or peptides to release free L-arginine.Enzymatic hydrolysis: Uses enzymes to specifically cleave L-arginine from proteins.3. Solvent Optimization:Determine the optimal solvent or solvent system for efficient extraction.Consider factors such as polarity, solubility, and selectivity for L-arginine.Avoid solvents that can adversely affect the stability or yield of L-arginine.4. pH Control:Maintain the pH of the extraction solution within a range that minimizes degradation or loss of L-arginine.Use pH buffers or adjust the pH using acids or bases as necessary.5. Temperature Management:Control the temperature during extraction to prevent thermal degradation.Use cooling or heating systems to maintain the desired temperature range.6. Purification Techniques:Employ appropriate purification techniques to remove impurities and contaminants from the extracted L-arginine. Common methods include:Ion exchange chromatography: Separates compounds based on their ionic charge.Size exclusion chromatography: Separates compounds based on their molecular size.Crystallization: Induces L-arginine precipitation for further purification.7. Quality Control:Implement rigorous quality control measures to verify the purity and identity of the purified L-arginine.Use analytical techniques such as HPLC, spectrophotometry, or amino acid analysis.中文回答：L-精氨酸的提取纯化注意事项。
精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定-最后
各种层析技术的主要原理
凝胶过滤层析
交联的葡聚糖凝胶
凝胶颗粒
凝胶颗粒内部的网状结构
表1 常用凝胶分离范围
凝胶类型及规格 葡聚糖凝胶 （ sephadex)
聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel ) 琼脂糖凝胶
（Sepharose）
G-200 G-100 G-50
G-25 P-300 P-150 2B 4B 6B
六、仪器使用
组装蛋白质 纯化系统
整
2
体
蛋
白
质
纯
化
1
3
系
统
4 1：自动馏分收集器 2：梯度混合仪 3：恒流泵 4：核酸蛋白检测仪
各种层析柱
梯度混合仪
核酸蛋白检测仪
光吸收值显示
样品池
灵敏度选择
调光吸收0
调透过率100
部分收集器
当前收集管号显示
洗脱液出口 收集管
当设置键盘 收集时间显示
流速显示窗 流速调节旋钮
分离范围 6×105 1.5×105 3×104
5×103 5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105
精氨酸激酶活力测定(连续测活法)
精氨酸激酶催化精氨酸与ATP合成磷酸精氨酸 时释放出质子 。L-arginine+Mg•ATP
N-phospho-L-argine+Mg•ADP+H+ 用酸碱指示剂 (0.15 g/ml百里酚蓝和 0.025 g/ml 甲酚红) 指示溶液中质子生成的量，可表示精氨酸激 酶的活性。反应液的pH稍大于8.0时，其575 nm 处的吸光值下降（2.2~1.4范围内）与溶液中H+浓 度的增加成线性关系。 精氨酸激酶的活力用 A575/sec 表示。
精氨酸激酶AK
加 样
阳 离 子 交 换 层 析 过 程
平 衡 液 洗
蛋白质
离子交 换树脂
高离子 强度洗 脱液洗
高离子 强度洗 脱液洗
收集
4 亲和层析
依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分 离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是 非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析 中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的 一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。
透析袋
小进行分离。
分离取决于 透析袋截留
浓缩的蛋白 混合样品
的分子量。
透析液
开始透析
处于平衡状态
2 层析原理
层析也称之色谱，基本原理是分析样品作 为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分 与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通 过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品 中各个成分的目的。
层析因固相介质不同又分为离子交换 层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。
水洗30分钟； (5)用1.5 M NaCl洗1小时；用Binding Buffer洗20分钟；蒸
馏水洗30分钟； (6)Ni柱再生：150 mL 0.1 M NiSO4洗→蒸馏水洗（穿流液
无色）→Binding Buffer平衡。
平衡：6倍柱床体积Binding Buffer（pH=8.0）平衡。
AK的检测
SDS-PAGE电泳： （1）安装双垂直板电泳槽； （2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL； （3）制样：取样品20 µL与样品缓冲液10 µL混合，100 ℃ 加热5分钟； （4）上样：用微量注射器加样15-20 µL （5）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶后 将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部； （6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几 分钟； （7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板 呈现淡蓝色。
l—精氨酸的提取纯化流程注意事项
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在进行精氨酸的提取纯化之前，首先要做好充分的准备工作。
锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究
锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病,随着社会进步和全球化进程的不断发展,食物过敏的发病率越来越高,成为全球关注的食品安全问题。
食物过敏主要由食物中蛋白质引起,主要症状有哮喘、荨麻疹等,严重的甚至会危及到生命。
水产品是最常见的过敏食物,水产食品中原肌球蛋白、小清蛋白等作为主要过敏原已得到国内外学者的广泛研究,而对于精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)是否为过敏原,其理化特性及致敏性如何,仍有待于进一步的研究证实。
锯缘青蟹(Scylla serrata)肉质鲜美,营养丰富,是我国蟹类增养殖的重要对象,深受我国消费者喜爱,同时其远销日本、东南亚等国家,也是全球的主要经济蟹类。
本研究以国内产量丰富的锯缘青蟹为研究对象,从分离纯化、抗体制备、分子克隆、原核表达、过敏原性等方面对精氨酸激酶进行了研究。
首先采用70-90 %硫酸铵沉淀及HiTrap Q亲和层析方法,从锯缘青蟹肌浆蛋白中分离得到分子量为40 kDa的天然蛋白(nAK),SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)及2D-PAGE(Two dimensional-PAGE,2D-PAGE)分析结果显示该蛋白的分子量为40 kDa、等电点为6.5,这与虾类精氨酸激酶Pen m 2性质相近。
兔抗白虾精氨酸激酶IgG抗体及兔抗锯缘青蟹精氨酸激酶IgG抗体的Western-blot结果表明纯化的锯缘青蟹40kDa蛋白为精氨酸激酶。
通过分子生物学技术方法,克隆得到锯缘青蟹精氨酸激酶开放阅读框基因序列。
测序结果显示,该开放阅读框基因的序列长度为1071 bp,编码356个氨基酸残基,该序列登录Genbank(GQ:851626)。
序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)精氨酸激酶基因的序列同源性高达94 %,与岸蟹(Carcinus maenas)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等甲壳类动物的精氨酸激酶也有较高的同源性(均>90 %)。
L-精氨酸简介
L_精氨酸的制备及提取研究（郝刚）
离子交换法从发酵液中提取L-精氨酸（张义萍、张伟国、郝刚） L-精氨酸菌种选育及优化方法（王学辉）
3、酶法 利用微生物中特定的酶作为催化剂，使底物经过酶 催化生成所需的产品 4、蛋白质水解提取法 以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、 碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各 种氨基酸
四、精氨酸的分离纯化
1、 特殊沉淀法
特殊沉淀法是采用某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性 衍生物的一种方法。常用的沉淀剂有苯甲醛
2、电渗析法 例如工业上从胱氨酸母液中提取 L-精氨酸时，向含有精氨酸的 原理：在中性条件下，酸性氨基酸是阴离子，碱性氨基酸是阳离 蛋白水解中和液中加入沉淀剂，使精氨酸与沉淀剂生成溶解度 子，中性氨基酸离子净电荷为零，在静电电场作用下，酸性氨基 很小的复合物（苯甲基精氨酸）而沉淀，实现精氨酸与其他氨 酸向阳极运动，碱性氨基酸向阴极运动，中性氨基酸仍停留在淡 基酸的分离。 化池中，初步实现分离；然后再将碱性氨基酸通过活性炭处理， 精氨酸被吸附，而赖氨酸不被吸附，达到分离与纯化的目的 3、离子交换法
一、精氨酸发酵的代谢控制育种策略
1、解除菌体自身的反馈抑制
精氨酸的生物合成受自身的反馈抑制和反馈阻遏，采用抗反馈调节 突变株来解除该反馈调节，使精氨酸得以积累。选育营养缺陷的回复 突变株也可以解除该反馈调节，如选育有N-乙酰谷胺酸激酶缺陷的回 复突变株。
2、增加前体物的合成
由代谢图可知，谷氨酸是精氨酸的生物合成的前体，因此，选育氟 乙酸、氟柠檬酸、重氮丝氨酸、酮基丙二酸、缬氨霉素等敏感突变株， 可以增加精氨酸前体的合成，从而有利于精氨酸产量的提高。
2）氮源 无机氮优于有机氮，无机氮中硫酸铵为最好。 随着硫酸铵浓度的增加精氨酸产量显著增加,但当硫酸铵浓度 超过5%时产酸又显著下降。 从碳源和氮源上来看，我们在发酵过程中为提高精氨酸的产 量应该选择过程中流加的方式。
03_精氨酸激酶(AK)的提取与纯化
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化张纯洁（湖北师范学院生物系 湖北黄石 435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。
当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。
加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。
通过CM-Cellulose阳离子交换层析，Sephacryl TM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。
关键词：精氨酸激酶提取与纯化Extraction and Purification of Arginine KinaseAbstract： Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate.E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LBmedium containing kanamycin (Final concentration: 25 μg/mL). Whenabsorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropylβ-D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation wascontinued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, thenthe crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified byfollowing three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchangechromatography, Sephacryl TM-100gel filtrate chromatography, andQ-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was foundto be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis.Key words: arginine kinase extraction and purification1引言精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。
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精氨酸激酶（AK）的提取与纯化张纯洁（湖北师范学院生物系 湖北黄石 435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。
当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。
加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。
通过CM-Cellulose阳离子交换层析，Sephacryl TM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。
关键词：精氨酸激酶提取与纯化Extraction and Purification of Arginine KinaseAbstract： Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate.E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LBmedium containing kanamycin (Final concentration: 25 μg/mL). Whenabsorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropylβ-D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation wascontinued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, thenthe crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified byfollowing three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchangechromatography, Sephacryl TM-100gel filtrate chromatography, andQ-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was foundto be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis.Key words: arginine kinase extraction and purification1引言精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。
AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。
按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina 中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
2实验材料以及实验试剂：2.1实验材料工程菌种：E．coli工程菌株Rossta2.2实验试剂LB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于950ml中，用NaOH调节pH至7.0，补加蒸馏水至总体积为1L，分装后高压蒸汽灭菌。
缓冲液：Buffer A：Tris 0.4 M、EDTA 1 mM、PMSF 25 μM、2-mercaptoethanol 10 mM、NaN3 5 μM，加入浓盐酸调pH 8.0；Buffer B：Tris 10 mM、EDTA 0.1 mM、2-mercaptoethanol 10 mM，加入浓盐酸调pH 8.0;贮存Buffer：Glycine 0.1 M，（NH4）2 SO4 3.2 M、2-mercaptoethanol 10 mM，加入NaOH 调至pH8.6;工作Buffer：Glycine 0.1M、2-mercaptoethanol 10mM，加入NaOH 调至pH8.6以上均为配制1L 溶液所需试剂量。
测活底物：57 mM Arg 2.0 ml、66 mM Mg(AC)2 2.0 ml、指示剂 2.0 ml、ATP 0.0532g，蒸馏水 14 ml加入NaOH调至pH8.2。
3实验方法3.1活化菌种取6支试管，各装有3 ml的LB液体培养基。
再各取工程菌种10 µl接入装有3 ml的LB液体培养基的试管（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/ml）中。
于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。
3.2扩大培养取6支1L锥形瓶，各装300 ml LB培养基。
将试管中活化的1 ml菌液接种到300 ml LB培养基，同时加入300 µl卡那青霉素（终浓度50 µg/ml）培养基于37 ℃恒温培养箱中培养2-3小时。
3.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时，各加150 μl的 IPTG至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。
3.4蛋白质提取（1）将上述各管于4 ℃，5000 r/m离心10 min；（2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加3 ml裂解液；（3）在冰上进行间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止；（4）于4℃，12000 rpm，离心10 min，取上清，得到AK的粗提液。
3.5蛋白质的检测◆测定AK的活性：新鲜配制测活底物，保存于4℃取5 μl上清加入装有1mlAK底物塑料比色皿迅速混匀，通过紫外分光光度法测A575下降值◆ SDS-PAGE电泳[3.4]：（1）安装双垂直板电泳槽；（2）配12%的分离胶15ml，浓缩胶5ml；（3) 制样：取样品10 µ1加样品缓冲液以40µ1混合，100℃加热5 min ， 15000×g，4℃离心1 min；（4）上样：用微量注射器加样15-20 µ1；（5）电泳：在凝胶上加80 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；（7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
3.6蛋白质的纯化（1）CMC阳离子交换层析平衡：3倍柱床体积Buffer A（pH=8.0）平衡上样：插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
将粗提液34ml上柱，流速约为1.4ml/min。
洗脱：Buffer A (pH=8.0)洗柱，同时在280nm处进行连续紫外检测，收集洗脱峰。
（2）S-100凝胶过滤层析平衡：3倍柱床体积Buffer B 透析平衡上样：待插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
稳定后将过CMC的洗脱液85 mL浓缩到50 mL 上柱，流速约1 ml/min。
洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱，同时在280 nm处进行连续紫外检测，根据电脑监测波峰收集蛋白并留样测活、电泳。
（3）Q-Sepharose阴离子交换层析平衡：3倍柱床体积Buffer B 透析平衡上样：待插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
稳定后将经过S-100处理的蛋白上柱，流速约1 ml/min。
洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱将Buffer B溶液和1mol/L NaCl的Buffer B溶液各300mL于梯度混合仪的两容器中逐步混合由低浓度到高浓度进行洗脱蛋白。
流速0.98mL/min同时在280nm处进行连续紫外检测，设定每根收集试管收集流出蛋白时间，根据微电脑记录仪显示曲线，分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
4结果与分析4.1蛋白质层析图谱图1-1. AK经CMC离子交换后的层析谱图如图1-1所示，由于CMC是阳离子交换树脂，而精氨酸（AK）在Buffer A（pH=8.0）下带负电荷，所以不被吸附在其上；带正电荷的杂蛋白会被吸附，因此可以我们得到的是一个主要由带负电荷形成的单一的峰。
图1-2 S-100凝胶层析谱图如图1-2 所示，将经CMC纯化后的蛋白溶液经浓缩，上样到分子筛S-100进一步分离纯化，得到几个洗脱峰。
分步收集每个峰的蛋白溶液进行活性检测，发现第一个峰含AK。
图1-3. AK经Q-sepharose离子交换后的层析谱图如图1-3 所示，将合并后的含AK蛋白溶液经Q－sepharose 纯化后得到如图，由于不同的蛋白在pH=8.0的BufferB缓冲液中所带电荷不同，与树脂的结合能力有差别，所以用盐进行洗脱时梯度时，会出现连续几个峰，所示结果。
活性检测显示第二个洗脱主峰含AK。
4.2 AK诱导表达电泳图1 2 3 4 5 MW(KD)2-1 AK经各步纯化与诱导表达对比电泳图1、经Q-sepharose离子交换后AK2、经S-100凝胶层析后AK3、经CMC离子交换后AK4、破壁后上清5、标准蛋白质5结果及讨论根据以上实验结果总结数据，我们计算得出在大肠杆菌Rossta中提取AK的各项得率如表5-1所示：Purification step V olume/mlTotalactivity/UTotalprotein/mgSpecificactivity/U·mg-¹PurificationfoldRecovery(％)上清 34 7309．32274．73 26．61 1 100 过CMC 85 6890．30235．98 29．20 1．10 94．27 过S-100 73 6373．78193．36 32．96 1．24 87．20 过Q 36．5 4393．1852．31 83．98 3．15 60．10表5-1由上表可以看出，在AK提取过程中，总的活力是逐级流失的，活力单位是递增的。