精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究_1[1].1精氨酸激酶_11_15

第一章引言
１．１　精氨酸激酶　
精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物的激酶。

它的作用是催化如下可逆反应：将ATP上的磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能键的储能分子――磷酸精氨酸。

反应方程式如下：
精氨酸＋ATP・
磷酸精氨酸＋ADP・Mg + H+
AK被发现已经超过70年的历史了, 它属于磷酸原（胍基化合物）激酶这个大家族中的一员。

现在已经在许多种无脊椎动物中发现了AK, 例如有鳌节肢动物(chelicerate arthropod) Limulus polyphemus[1], 腹足动物(gastropod) Cellana grata 和Aplysia kurodai [2]，海参Stichopus japonicus[3]，头足类动物Nautilus pompilius[4]，龙虾(lobster) Homarus vulgaris[5]，海葵（sea anemone）Anthopleura japonicus[6]，海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus[7]等无脊椎动物中都已经分离得到了AK。

尽管说基本功能都是催化同样的高能磷酸键转移反应，但是从不同的无脊椎动物体内得到的AK的结构和分子量大小却存在着很大的差异。

这些不同的精氨酸激酶结构和大小有以下类别：（1）单亚基，如海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus 的AK[7]，是一种相对分子量约为40 kDa的单亚基的蛋白质。

单亚基的AK是目前研究最多的一种AK。

本论文中用到的AK就是单亚基，相对分子量约为40 kDa。

（2）双亚基，如海参Stichopus japonicus中分离得到的AK就是一种相对分子量约为84 kDa的双亚基蛋白质[3]。

（3）四个亚基，如环节动物（annelid）Sabella pavonina中具有相对分子量在150～160 kDa之间的四亚基AK[8]。

来自于某些物种的精氨酸激酶的晶体结构现在已经被解析了出来。

早在1998年， Zhou等人已经利用来自于马蹄蟹（horseshoe crab）Limulus polyphemus 的单亚基的AK解出了结合有过渡态类似物的AK的过渡态的晶体结构（分辨率：1.86 Å）[9]。

结果显示AK由一个小的全α－螺旋的N端结构域和一个大的C 端结构体（112号－357号残基）组成。

C端结构域和谷氨酸合成酶的C端结构域相似，8股反平行β－折叠被7个α－螺旋包绕着（见图1－1）。

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从这个结构上看，过渡态类似物并不是结合在两个结构域中间，而是结合在C端结构域内部，也就是说AK的活性部位是在C端。

此外C端结构域可以分为两个小的结构体，而过渡态类似物就结合在这两个结构域的连接处。

按照邹承鲁先生的观点，酶的活性部位是处于一个比较柔性的部位，这个部位的结构比别的部位更容易受到外界不利因素的影响，其结果是酶的活性的丧失要较酶的整个结构的丧失更快、更容易[10]。

在单亚基AK中，活性部位柔性的研究还未见诸报道过。

不过预计AK活性部位和总体结构的关系应该和双亚基的兔肌肌酸激酶（creatine kinase,CK. E.C.2.7.3.2）的情况有些类似。

因为双亚基的兔肌CK晶体的结构显示，CK中一个单亚基也是由一个小的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，而且与过渡态类似物结合形成的过渡态结构显示，过渡态类似物与CK结合的部位也不在C端结构域和N端结构域中间，而是在大的C端结构域的中间，且结合部位也是C端结构域中两个相对独立的结构的连接处。

CK的C 端结构域也主要是由α－螺旋包绕着的反平行β－折叠组成的[11]。

单亚基AK与双亚基CK的稳定性可能会有很大的不同，因为双亚基CK的两个亚基之间氢键对保持蛋白质的稳定是起到很大作用的[11]。

图１－１　
结合有过渡态类似物的AK的晶体结构。

（原图见Zhou等人的文章[9]。

）　
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单亚基AK和CK的一个亚基的结构上的相似与功能上的相似是一致的，它们都是催化能量转移的激酶一个家族中的成员，且二者之间存在着进化关系缘故。

不仅如此，二者之间在氨基酸组成上也有很大的相似性。

表1－1 是转引自France等人文章[7]中的一个表，表中列出了几种来源的AK和CK的氨基酸组成，从中可以看出，这二者之间存在着很大的同源性。

表１－１ 精氨酸激酶与肌酸激酶氨基酸组成的比较　
氨基酸 龙虾ａ 对虾ｂ 马蹄蟹ｃ 蓝蟹ｄ 对虾ｅ 兔ｆ　
(AK) (AK)(AK)(AK)(AK)(CK) Ａｓｐ ２８ ３７ ４４ ３７ ３５ ２８　
Ｔｈｒ ２１ ２０ ２５ ２０ １９ １８　
Ｓｅｒ ２０ １７ ２１ １６ １９ ２２　
Ｇｌｕ ３３ ３９ ３６ ４１ ４４ ２７　
Ｐｒｏ １１ １２ １３ １１ １２ １９　
Ｇｌｙ ２８ ２７ ２５ ２８ ２８ ３３　
Ａｌａ ２８ ２２ １７ ２１ ２２ １３　
Ｖａｌ ２２ １９ １６ ２３ ２２ ２８　
Ｍｅｔ ８ ４ ６ ７ ９ １１　
Ｉｌｅ ２０ １３ １５ １３ １６ １４　
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Ｌｅｕ ３３ ３４ ３４ ３２ ３５ ３７　
Ｔｙｒ １１ １２ ９ １１ １２ １０　
Ｐｈｅ ２０ １８ １６ １５ １８ １６　
Ｈｉｓ ８ ９ ８ ８ ９ １７　
Ｌｙｓ ３１ ２８ ３２ ２９ ３０ ３４　
Ａｒｇ １９ １７ １６ １５ １７ １８　
Ｃｙｓ ６ ５ ５ ５ ５ ４　
Ｔｒｐ ２ ３ ３ ２ ２ ４　
注：（a）龙虾(lobster) Homarus vulgarus AK的数据来自于Terrossian et al.的文章[12]。

（b）对虾(shrimp) Penaeus aztecus AK的数据来自于France R.M. et al. 的文章[7]。

（c）马蹄蟹(horse-shoe crab) Limulus polyphemus的数据来自于Strong et al.的文章[1]。

（d）蓝蟹（blue crab）Callinectus sapidus的数据来自Blethen 和Kaplan的文章[13]。

（e）对虾（shrimp） Penaeus japonicus的数据来自于Suzuki 和Furukohri的文章[14]。

（f）兔肌肌酸激酶的数据来自于B abbit et al.的文章[15]。

不仅如此，尽管说AK和CK的底物，即精氨酸（arginine, Arg）和肌酸（creatine）,以及磷酸精氨酸（arginine phosphate）和磷酸肌酸（cr eatine phosphate），有很大的不同，但是AK和CK的催化机制被认为是相同的，即在所结合的底物之间进行γ－磷酰基转移（associatine in-lin
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e γ-phosphoryl transfer）[16]。

用AK与底物拟似物结合得到的过渡态结构的精细的晶体结构（分辨率为 1.2 Å ）支持这种催化机制，这个精细的结构显示出底物在活性部位的精确排列对于催化很重要，此外Mg 2＋的存在对于AK的活性部位保持一定的构象是必需的[17]。

目前用来自于Torpedo californica的CK与底物拟似物结合形成的过渡态拟似物得到的晶体结构显示CK的催化机制也是这种机制[18]。

之所以AK和CK在结构、氨基酸残基组成、催化机制等方面有很大的类似性，是因为AK和CK在进化上具有很密切的关系。

传统的观点认为AK是磷酸原激酶家族中最为原始的成员，而家族中的其它成员，包括CK，是来自于一前一后的基因复制和继发的分化。

这种观点的依据主要是：（1）AK直接利用现成的一种氨基酸，精氨酸，作为底物，而其它的磷酸原激酶则利用的是一些氨基酸的次级衍生胍基化合物；（2）AK存在于大量的无脊椎动物体内，包括那些最原始的无脊椎动物体内；（3）AK一般是单亚基蛋白质，而其它的磷酸原激酶家族成员多为多亚基的蛋白质。

不过现在也发现了双亚基的AK可能是从CK进化而来的证据：cDNA顺序比较显示来自于Stichopus japonicus的双亚基的AK在全部氨基酸顺序上更接近于脊椎动物的CK，而不是磷酸原激酶家族中其它种类的AK。

这意味着在磷酸原激酶家族的进化过程中，AK 至少经历了两个阶段的进化：第一个阶段发生在磷酸原激酶进化的早期，其后代激酶是软体动物和节肢动物的AK，第二阶段发生在多细胞动物进化的后期，从CK进化而来[19]。

１．２　蛋白质折叠研究的概述　
１．２．１　蛋白质折叠研究的概况　
蛋白质折叠机制的研究是当前蛋白质化学和分子生物学的研究前沿之一，近年来备受关注。

在生物体内，生命信息的流动可以分为两个部分：第一部分是储存于DNA序列中的遗传信息通过转录和翻译传入蛋白质的一级序列中，这是一维信息之间的传递，三联子密码介导了这一传递过程；第二部分是肽链经过疏水塌缩、空间盘曲、侧链叠集等折
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