生物化学实验PPT课件：精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定
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【课件】医学生物化学实验课程PPT
常用于测定核酸和蛋白质的浓 度，酶反应的动力学研究等。
步骤
准备标准曲线、设置光程、选 择波长、测量吸光度和计算样 品浓度。
凝胶电泳
SDS-PAGE凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
通过凝胶电泳分离和分析蛋白质。
用于分离和分析核酸，如DNA和 RNA。
非变性凝胶电泳
用于分离和分析蛋白质的三维空 间结构。
西方博洛法
戴好实验手套、口罩和实验服，避免有害物质接触。
3 合理使用实验室设备
学习如何使用化学品和设备，遵守正确的使用方法。
4 注意实验室卫生
保持实验台清洁，妥善处理废弃物和化学品。
酶活性测量
实验原理
通过测量酶催化反应速率来评 估酶活性。
实验步骤
包括制备反应混合物、控制反 应条件和测定反应速率。
数据分析
通过绘制酶活性曲线和计算酶 活性单位来解释实验结果。
医学生物化学实验课程 PPT
探索医学生物化学实验课程，从实验室中的安全措施、基本技术和设备开始， 到酶活性测量、蛋白质层析纯化、蛋白质浓度测定、分光光度法、凝胶电泳 以及PCR等。拓展知识边界，发现医学化学的奥秘。
实验室安全
1 仔细阅读实验手册
熟悉实验步骤和安全规定，确保操作正确。
2 穿戴个人防护装备
蛋白质层析纯化
1
树脂选择
选择合适的层析树脂来分离和纯化目标
制备样品和柱子
2
蛋白质。
预处理样品，并准备层析柱和缓冲溶液。
3
样品加载
将样品加载到层析柱中，充分与树脂互
洗脱和回收
4
作用。
使用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白质，并收 集纯化的样品。
蛋白质浓度测定
1 布鲁克法
生物化学实验PPT课件：精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定
四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀 根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱 用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先 在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开 柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。 酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液， 立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时 停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一 个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
• 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? • 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ • 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ • 4. 如何确定目的蛋白？ • 5. 如何评价蛋白质纯度？ • 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白
质 含量和活性？
精氨酸激酶的提取、 分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料、仪器和试剂 • 实验操作步骤 • 仪器使用 • 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离 纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的 蛋白质的确定方法。
二、原理
凝胶过滤(Gel Fitration Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是 混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离 的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间 的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶 颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质 可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到 分离的目的。
生物化学试验课件
目录
实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 (操作性) 4学时 实验二 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 (操作性) 3学时 实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 (验证性) 5学时 实验四 动物肝肝脏DNA的分离与鉴定 (操作性) 3学时 实验五 血液中葡萄糖的测定 (操作性) 3学时 实验六 血清中总胆固醇的测定 (操作性) 4学时 实验七 唾液淀粉酶活性的观察 (综合性) 4学时 实验八 维生素C的定量测定 (操作性) 4学时 实验九 脂肪酸的β-氧化 (操作性) 4学时
【注意事项】
1．醋酸纤维素薄膜的质量对结果影响很大，最好选用 同一批号、薄膜厚度均匀、质量良好的醋酸纤维素薄膜。 2．血清或其他电泳样品应新鲜。 3．点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样 位置要合适。 4．盐桥要放置平整，保证电场均匀。 5．电泳槽盖应密封，盖内空间不宜过大。 6．较低温度下电泳一般能获得较好的图谱，故室温不 宜过高。 7．选择合适的缓冲液离子强度。
【实验步骤】
1．薄膜准备 2．点样
3．电泳
4．染色和漂洗 +
白蛋白(A)
α2
β
γ
α1
5．薄膜和透明
6．定量
（1）洗脱法
每种蛋白占总蛋白量的
百分数（%）
该种蛋白管光密度读数 各管光密度读数之和
100 %
注意！白蛋白因加入NaOH的量比其他管多，其光密度值 应乘以稀释倍数，得到数值再代入上式中计算。
8．两电泳槽内缓冲液面应在同一水平。 9．要控制好电流，电压和电泳时间。 10．电泳槽内缓冲液可以多次使用。但操作时应尽量减 少缓冲液的污染、水分蒸发、pH及离子强度的改变， 并应防止霉菌的滋长。 11．染色、漂洗及洗脱时间要控制好，才能获得重复性 良好的定量结果。
生物化学检验ppt课件
酶类CK-MB,α-AMY等。
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、
酶的提取与分离纯化ppt课件
整理版课件
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4.干燥法
气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥
使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、 丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被 抽提出来。
气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
整理版课件
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三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
整理版课件
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5.其他方法
1. X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa 以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破 碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起 的。
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及 活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。
整理版课件
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3. 反复冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键 结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变 化，引起细胞膨胀而破裂。
适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融 过程中可能引起某些蛋白质变性。
整理版课件
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化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
整理版课件
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（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结 构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持， 一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落， 使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补， 从而导致内层膜通透性的增强。
《精氨酸刺激试验》课件
确保相关仪器设备处于良 好状态，校准准确，确保 血样采集和检测的准确性 。
知情同意
向受试者详细解释试验目 的、过程和可能的副作用 ，并签署知情同意书。
精氨酸的注射与采集血样
精氨酸注射
按照规定的剂量和速度，将精氨 酸注射到受试者的静脉中。
血样采集
在注射前、注射后特定时间点采 集血样，用于检测相关激素和代 谢产物的水平。
操作复杂度与误差
精氨酸刺激试验需要严格的操作规程 和精确的剂量控制，否则可能导致结 果不准确。
VS
由于操作复杂，可能需要专业的医务 人员来完成，这增加了试验成本和时 间。
对患者的潜在风险
精氨酸刺激试验可能导致患者血压波动、心率失常等不良反应，需要密切监测。
对于某些患者，精氨酸刺激试验可能引发严重的并发症，如过敏反应、心肌梗死等。
精氨酸是一种氨基酸，在人体内具有多种生理功能，包括促 进血管舒张和调节血压等。精氨酸刺激试验通过注射精氨酸 来刺激心血管系统，观察心血管系统的反应。
精氨酸刺激试验的原理
精氨酸刺激试验的原理基于精氨酸的生理作用。精氨酸能 够刺激一氧化氮合酶的活性，促进一氧化氮的生成。一氧 化氮是一种重要的血管舒张因子，能够扩张血管，降低血 压。
精氨酸刺激试验
目录
CONTENTS
• 精氨酸刺激试验简介 • 精氨酸刺激试验的步骤 • 精氨酸刺激试验的结果解读 • 精氨酸刺激试验的临床意义 • 精氨酸刺激试验的局限性 • 精氨酸刺激试验的未来展望
01
精氨酸刺激试验简 介
精氨酸刺激试验的定义
精氨酸刺激试验是一种用于评估心血管功能和诊断相关疾病 的检查方法。它通过观察精氨酸对心血管系统的反应来评估 心血管功能。
异常结果解读
知情同意
向受试者详细解释试验目 的、过程和可能的副作用 ，并签署知情同意书。
精氨酸的注射与采集血样
精氨酸注射
按照规定的剂量和速度，将精氨 酸注射到受试者的静脉中。
血样采集
在注射前、注射后特定时间点采 集血样，用于检测相关激素和代 谢产物的水平。
操作复杂度与误差
精氨酸刺激试验需要严格的操作规程 和精确的剂量控制，否则可能导致结 果不准确。
VS
由于操作复杂，可能需要专业的医务 人员来完成，这增加了试验成本和时 间。
对患者的潜在风险
精氨酸刺激试验可能导致患者血压波动、心率失常等不良反应，需要密切监测。
对于某些患者，精氨酸刺激试验可能引发严重的并发症，如过敏反应、心肌梗死等。
精氨酸是一种氨基酸，在人体内具有多种生理功能，包括促 进血管舒张和调节血压等。精氨酸刺激试验通过注射精氨酸 来刺激心血管系统，观察心血管系统的反应。
精氨酸刺激试验的原理
精氨酸刺激试验的原理基于精氨酸的生理作用。精氨酸能 够刺激一氧化氮合酶的活性，促进一氧化氮的生成。一氧 化氮是一种重要的血管舒张因子，能够扩张血管，降低血 压。
精氨酸刺激试验
目录
CONTENTS
• 精氨酸刺激试验简介 • 精氨酸刺激试验的步骤 • 精氨酸刺激试验的结果解读 • 精氨酸刺激试验的临床意义 • 精氨酸刺激试验的局限性 • 精氨酸刺激试验的未来展望
01
精氨酸刺激试验简 介
精氨酸刺激试验的定义
精氨酸刺激试验是一种用于评估心血管功能和诊断相关疾病 的检查方法。它通过观察精氨酸对心血管系统的反应来评估 心血管功能。
异常结果解读
《生物化学实验》PPT课件
蛋白质从“－”极向“＋”极移 动，从浓缩胶进入分离胶，速 度变慢，堆积浓缩。
缓冲 液
浓缩胶
分离胶
蛋白质样品进入分离胶后
pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增 大，不存在快、慢离子之分， 蛋白质样品在均一电场强度和 pH条件下泳动。
由于各种蛋白质pI不同，所载有 效电荷不同，因此质点的 有效 迁移率不同，形成不同区带。
交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)
O
O
CH2=CH-C-NH -CH2-NH-C-CH=CH2
催化剂 聚合形成的三维网状结构。
催化剂
（1）过硫酸铵-TEMED系统 碱性条件下催化作用 温度与聚合快慢成正比 （2）核黄素-TEMED系统 光激发的催化反应 用量少，对分析样品无影响 聚合时间可自由控制
4
2
64
64
48
32
20
12
322
40
40
8
20
30
4
12
2
纸层析
纸层析是最简单的液一液相分配层析。 滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，
大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此， 纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相 混溶的有机溶剂为层析的流动相。 对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定 的温度条件下，Rf是个常数。
大分子物质; 高压电泳(500—1000V). 20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、
核苷酸等小分子物质; （2）溶液的pH值 pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大； （3）溶液离子强度 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。 （4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同 时起作用
缓冲 液
浓缩胶
分离胶
蛋白质样品进入分离胶后
pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增 大，不存在快、慢离子之分， 蛋白质样品在均一电场强度和 pH条件下泳动。
由于各种蛋白质pI不同，所载有 效电荷不同，因此质点的 有效 迁移率不同，形成不同区带。
交联剂：甲叉双丙稀酰胺交联剂(Bis)
O
O
CH2=CH-C-NH -CH2-NH-C-CH=CH2
催化剂 聚合形成的三维网状结构。
催化剂
（1）过硫酸铵-TEMED系统 碱性条件下催化作用 温度与聚合快慢成正比 （2）核黄素-TEMED系统 光激发的催化反应 用量少，对分析样品无影响 聚合时间可自由控制
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纸层析
纸层析是最简单的液一液相分配层析。 滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，
大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此， 纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相 混溶的有机溶剂为层析的流动相。 对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定 的温度条件下，Rf是个常数。
大分子物质; 高压电泳(500—1000V). 20—200V/cm，几分钟；氨基酸、小肽、
核苷酸等小分子物质; （2）溶液的pH值 pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大； （3）溶液离子强度 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快。 （4）电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同 时起作用
体液中酶的生物化学检验 ppt课件
（二）参考区间 男性：11--50U/L 女性：7--32U/L
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（三）临床意义
1、肾脏疾病：血清中GGT活性升高不明显 2、肝脏疾病： （1）诊断恶性肿瘤肝转移和肝癌术后复发情况，阳性 率可达90% （2）GGT同工酶II与AFP联合检测可原发性肝癌的检 测阳性率明显升高 3、嗜酒或长期服用某种药物
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三、γ-谷氨酰转移酶（GGT）
是一种含巯基的线粒体酶，参与体内谷胱
甘肽的代谢。肾脏、肝脏和胰腺中含量丰富，
但血清中GGT主要来自肝胆系统。GGT在肝 脏中广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整 个胆管系统，因此肝内合成亢进或胆汁排出 受阻时，血清中GGT升高。
19
（一）检测方法
碱性条件下GCNA与甘氨酰甘氨酸反应的方法
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（1-12岁 <500U/L ; >15岁 40--150U/L
男性：1-12岁 <500U/L；
12-15岁 <750U/L；
>25岁 40--150U/L
30
（三）临床意义
肿瘤、恶性肿瘤骨转移等
升高
1、骨骼疾病：变形性骨炎、佝偻病、软骨病、骨恶性
2、肝胆疾病：阻塞性黄疸、肝硬化、肝坏死、原发性 和继发性肝癌时明显升高；肝细胞性黄疸升高不明显。
3、肿瘤：乳腺癌、肺癌等
4、其他疾病：甲状腺及甲状旁腺功能亢进、遗传性
ALP过多症
5、药物：巴比妥类、抗生素等
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七、酸性磷酸酶（ACP）
酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化磷酸 单酯水解生成无机磷酸的水解酶。人血清
真性胆碱酯酶（AChE）和假性胆碱脂酶
（PChE）。真性胆碱酯酶也称乙酰胆碱酯酶主要
存在于胆碱能神经末梢突触间隙，PChE又称血清
精氨酸激酶的提取、分离、纯化及活力测定-最后
各种层析技术的主要原理
凝胶过滤层析
交联的葡聚糖凝胶
凝胶颗粒
凝胶颗粒内部的网状结构
表1 常用凝胶分离范围
凝胶类型及规格 葡聚糖凝胶 （ sephadex)
聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel ) 琼脂糖凝胶
（Sepharose）
G-200 G-100 G-50
G-25 P-300 P-150 2B 4B 6B
六、仪器使用
组装蛋白质 纯化系统
整
2
体
蛋
白
质
纯
化
1
3
系
统
4 1：自动馏分收集器 2：梯度混合仪 3：恒流泵 4：核酸蛋白检测仪
各种层析柱
梯度混合仪
核酸蛋白检测仪
光吸收值显示
样品池
灵敏度选择
调光吸收0
调透过率100
部分收集器
当前收集管号显示
洗脱液出口 收集管
当设置键盘 收集时间显示
流速显示窗 流速调节旋钮
分离范围 6×105 1.5×105 3×104
5×103 5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105
精氨酸激酶活力测定(连续测活法)
精氨酸激酶催化精氨酸与ATP合成磷酸精氨酸 时释放出质子 。L-arginine+Mg•ATP
N-phospho-L-argine+Mg•ADP+H+ 用酸碱指示剂 (0.15 g/ml百里酚蓝和 0.025 g/ml 甲酚红) 指示溶液中质子生成的量，可表示精氨酸激 酶的活性。反应液的pH稍大于8.0时，其575 nm 处的吸光值下降（2.2~1.4范围内）与溶液中H+浓 度的增加成线性关系。 精氨酸激酶的活力用 A575/sec 表示。
精氨酸制备(生物分离纯化技术课件)
精氨酸制备 实训原理
氨基酸是两性电解质，有一定的等电点，在溶液pH小于其pI时带正 电，大于其pI时带负电。故在一定的pH条件小，各种氨基酸的带电情况 不同，与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同。因而得到分离。
本实验选用盐酸水解猪血粉，而后采用阳离子交换剂法制备精氨酸， 最后应用浓缩干燥结晶法制备精氨酸。
精氨酸制备
实训试剂与设备
一、试剂和材料 猪血粉、001树脂、盐酸：工业规格（约10当量）、 阳离子交换水、0.1N NH3-NH4CL、0.2N NH4OH。
二、实验器材
耐酸瓷砖衬里水解池，内玻璃钢盘管 通蒸汽加热；色谱柱（2700×600mm） 过滤机、搅拌器、浓缩干燥器 电子天平 。
精氨酸制备
4、营养增补剂：精氨酸是鸟氨酸循环中的一个组成成分具有极其重 要的生理功能。多吃精氨酸，可以增加肝脏中精氨酸(arginase)的活性， 有助于将血液中的氨转变为尿素而排泄出去。所以，精氨酸对高氨血症， 肝脏机能障碍等均有功效。
精氨酸制备 实训目标
1.采用水解法完成精氨酸的制备。 2.采用离子交换方法进行精氨酸的纯化。 3.采用干燥结晶法进行精氨酸精制 。
2、作为前体：精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前 体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。
精氨酸制备 产品简介 二、产品用途
3、压抑病毒复制：细胞培植研究指出当有机体外（试管内）赖氨酸 与精氨酸的比例偏向赖氨酸时，可以压抑病毒的复制。在治疗上的成效却 是未知的，但食用精氨酸会影响注射赖氨酸的效用。
生产实训 一、生产前准备 1、检查生产原料、各种生产用试剂； 2、检查生产设备； 3、检查生产记录等文件。 二、生产操作 1、生产前准备
《生物化学》第四节 酶的活力测定及分离提取
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Vm [I]
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Km
+ [S]
[I]
1 + Ki
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反竞争性抑制的双倒数方程
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反竞争性抑制的双倒数图形特征
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反竞争性抑制的特点：
⑴ 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的 分子结构类似；
⑵ 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合； ⑶ 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制
第四节 酶的活力测定及分离提取
一、酶活力的测定 （一）活力（性）的表示方法 （二）测定 二、酶的分离提取
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一、酶活力的测定
（一）活力（性）的表示方法 １、活力—— v
测定酶活力就是测定酶促反应速度。 v ：单位时间内产物的生成量。
单位时间内底物的消耗量。
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2、酶的活力单位（U）：一定条件下，单位 时间内催化一定量的底物起反应所需的酶 量。 1 个酶活力单位（U） ，是指在特定条件下， 在1 分钟内能转化1 微摩尔（μmol）底物的 酶量或是转化底物中1μmol 的有关基团的酶 量。
（3）低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低， 但温度升高后，酶活性又可恢复。
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六、激活剂对υ的影响
能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激 活剂。 1、无机离子 阴离子 Cl－、Br－ ； 阳离子 H+
金属离子（Zn2+、Cu2+、K+等）。 2、中等大小的有机分子：GSH、Cys、VC、巯基
复合物结合，使酶的催化活性降低，称为 非竞争性抑制。
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反应模式
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反竞争反应模式
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反竞争性抑制的速度方程
Vm [I]
· [S]
1 + Ki
=
Km
+ [S]
[I]
1 + Ki
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反竞争性抑制的双倒数方程
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反竞争性抑制的双倒数图形特征
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反竞争性抑制的特点：
⑴ 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的 分子结构类似；
⑵ 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合； ⑶ 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制
第四节 酶的活力测定及分离提取
一、酶活力的测定 （一）活力（性）的表示方法 （二）测定 二、酶的分离提取
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一、酶活力的测定
（一）活力（性）的表示方法 １、活力—— v
测定酶活力就是测定酶促反应速度。 v ：单位时间内产物的生成量。
单位时间内底物的消耗量。
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2、酶的活力单位（U）：一定条件下，单位 时间内催化一定量的底物起反应所需的酶 量。 1 个酶活力单位（U） ，是指在特定条件下， 在1 分钟内能转化1 微摩尔（μmol）底物的 酶量或是转化底物中1μmol 的有关基团的酶 量。
（3）低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低， 但温度升高后，酶活性又可恢复。
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六、激活剂对υ的影响
能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激 活剂。 1、无机离子 阴离子 Cl－、Br－ ； 阳离子 H+
金属离子（Zn2+、Cu2+、K+等）。 2、中等大小的有机分子：GSH、Cys、VC、巯基
复合物结合，使酶的催化活性降低，称为 非竞争性抑制。
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反应模式
课件一、氨基酸提取及精制技术.
氨基酸提取与精制概述源自（二）氨基 酸提取与精 制要求
①条件温和，经分离、纯化后能够 保持产物原有的性质； ②所采用分离纯化技术的选择性好， 能够从发酵液中有效地将目的氨基 酸分离出来，分离出来的产品纯度 满足质量要求； ③氨基酸提取与精制的总收率高。 ④满足产品质量要求的情况下，尽 量降低分离纯化成本； ⑤产物提取与精制过程尽量减少环 境污染，并有利于副产物的综合利 用。
氨基酸提取与精制概述 发酵液
（三）氨 基酸提取 与精制的 一般程序
预处理 （调节pH、温度、除菌体、除杂质等） 提取 （从发酵液中分离氨基酸） 精制 （从提取产物中进一步纯化）
课件一、氨基酸提取与精制概述
（一）氨基 酸发酵液的 一般特征
①发酵液大部分是水，含量一般 在80%以上； ②发酵液中的目的氨基酸含量一 般为5%～18%； ③发酵液中的悬浮固体物主要含 有菌体和蛋白质胶状物； ④发酵液含有培养基残留的各种 成分，包括糖类、无机盐类、有 机色素物质以及消泡剂等； ⑤发酵液中除了目的代谢物外， 常有其它少量的代谢产物。
①条件温和，经分离、纯化后能够 保持产物原有的性质； ②所采用分离纯化技术的选择性好， 能够从发酵液中有效地将目的氨基 酸分离出来，分离出来的产品纯度 满足质量要求； ③氨基酸提取与精制的总收率高。 ④满足产品质量要求的情况下，尽 量降低分离纯化成本； ⑤产物提取与精制过程尽量减少环 境污染，并有利于副产物的综合利 用。
氨基酸提取与精制概述 发酵液
（三）氨 基酸提取 与精制的 一般程序
预处理 （调节pH、温度、除菌体、除杂质等） 提取 （从发酵液中分离氨基酸） 精制 （从提取产物中进一步纯化）
课件一、氨基酸提取与精制概述
（一）氨基 酸发酵液的 一般特征
①发酵液大部分是水，含量一般 在80%以上； ②发酵液中的目的氨基酸含量一 般为5%～18%； ③发酵液中的悬浮固体物主要含 有菌体和蛋白质胶状物； ④发酵液含有培养基残留的各种 成分，包括糖类、无机盐类、有 机色素物质以及消泡剂等； ⑤发酵液中除了目的代谢物外， 常有其它少量的代谢产物。
生物化学课件
硫辛酸
烷基
钴胺素辅酶类
二氧化碳
生物素
氨基
磷酸吡哆醛
甲基、甲烯基、 四氢叶酸
甲炔基、甲酰基
等一碳单位
尼克酰胺（维生素PP之一）
尼克酰胺（维生素PP之一）
维生素B2 （核黄素） 维生素B2 （核黄素） 维生素B1（硫胺素） 泛酸 硫辛酸 维生素B12 生物素 吡哆醛（维生素B6之一） 叶酸
辅助因子分类 （按其与酶蛋白结合的紧密程度）
第1大类，氧化还原酶 第1亚类，氧化基团CHOH 第1亚亚类，H受体为NAD+ 该酶在亚亚类中的流水编号
三、酶的化学本质
❖ 一、蛋白质 ❖ 二、核酸
❖ 单体酶(monomeric enzyme)： 由单条肽链构成,仅具有三级结构的酶。
❖ 寡聚酶(oligomeric enzyme)： 由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。
辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的 方法除去。
辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超 滤的方法除去。
辅酶的作用1
参与基团的转移: 氨基------磷酸吡哆醛(Vit B6) 羧基------生物素(biotin)、维生素K 一碳单位------四氢叶酸(folic acid) 甲基------维生素B12 酰基-----辅酶A、硫辛酸
活性中心内的必需基团
结合基团 (binding group) 与底物相结合
催化基团 (catalytic group) 催化底物转变成产物
活性中心外的必需基团 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有
的空间构象所必需。
酶的活性中心常位于酶蛋白分子表面，为含有 较多疏水氨基酸残基，形成疏水性“裂缝”或 “口袋”，形成了利于酶促反应发生的疏水环 境
精氨酸激酶实验报告
一、实验目的1. 了解精氨酸激酶的基本性质和作用。
2. 掌握精氨酸激酶的活性测定方法。
3. 分析不同条件对精氨酸激酶活性的影响。
二、实验原理精氨酸激酶（Arginase）是一种非特异性酶，主要存在于哺乳动物细胞中，能够催化精氨酸与鸟苷三磷酸（GTP）反应生成鸟氨酸和焦磷酸（PPi）。
本实验通过测定精氨酸激酶催化反应的速率，来评价其活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 精氨酸激酶- 精氨酸- GTP- 磷酸缓冲液- 丙酮- 丙酮酸钠- 氯化钠- 氨水- 氢氧化钠- 硫酸铜- 氯化钡- 氢氧化钠溶液- 精氨酸激酶底物溶液- 比色计- 移液器- 电子天平- 恒温水浴锅2. 实验试剂：- 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）- 0.1mol/L GTP溶液- 0.1mol/L精氨酸溶液- 0.1mol/L丙酮溶液- 0.1mol/L丙酮酸钠溶液- 0.1mol/L氯化钠溶液- 0.1mol/L氨水溶液- 0.1mol/L氢氧化钠溶液- 0.1mol/L硫酸铜溶液- 0.1mol/L氯化钡溶液四、实验方法1. 配制精氨酸激酶底物溶液：- 称取一定量的精氨酸和GTP，溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液中，配制成一定浓度的底物溶液。
2. 精氨酸激酶活性测定：- 取一定量的精氨酸激酶溶液，加入底物溶液，混匀后置于恒温水浴锅中，在特定温度下反应。
- 在反应过程中，每隔一定时间取样，测定反应液中的GTP浓度。
- 通过比较不同时间点GTP浓度的变化，计算精氨酸激酶的活性。
3. 影响因素分析：- 研究不同pH、温度、底物浓度、酶浓度等因素对精氨酸激酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 精氨酸激酶活性测定结果：- 在实验条件下，精氨酸激酶的活性为X U/mL。
2. 影响因素分析结果：- pH：精氨酸激酶的最适pH为7.4。
- 温度：精氨酸激酶的最适温度为37℃。
- 底物浓度：在一定范围内，底物浓度越高，精氨酸激酶活性越高。
2019_学年高中生物第3章酶的制备及应用第1节酶的制备及活力测定课件中图版选修
5．测定吸光值：测定吸光值时要把反应液与 2mL3,5—二硝基水杨酸
试剂
混匀，并沸水浴5 min，才能产生 麦芽糖 产物。然后分别移入四支 比色杯 ，用分 光光度计在波长 520 nm处进行比色。
6．绘制标准曲线。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中 问题1 问题2 问题3 问题4
探究影响酶活力的因素
(2016· 全国甲卷)为了研究温度对某种酶活性的影响，设置三个实验 组：A 组(20 ℃)、B 组(40 ℃)和 C 组(60 ℃)，测定各组在不同反应时间内的产物浓 度(其他条件相同)，结果如图。回答下列问题：
(1)三个温度条件下，该酶活性最高的是________组。 (2)在时间 t1 之前，如果 A 组温度提高 10 ℃，那么 A 组酶催化反应的速度会 ________。 (3)如果在时间 t2 时，向 C 组反应体系中增加 2 倍量的底物，其他条件保持不 变，那么在 t3 时，C 组产物总量________，原因是_________________________。 (4)生物体内酶的化学本质是____________，其特性有____________(答出两点 即可)。
(5)如图(虚线所示)
制备酶时应注意选材，具体有： (1)所要制备的酶是什么酶 (2)它所存在的组织或细胞 (3)含量较多的时期
2．(2012· 广东高考)食品种类多，酸碱度范围广。生物兴趣小组拟探究在食品 生产中应用范围较广的蛋白酶，查阅相关文献，得知： (1)pH 对不同蛋白酶的活力影响有差异。据图可知，________更适宜作为食品 添加剂，理由是___________________________________。 蛋白酶的活力可用____________________________的量来表示。
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三、材料、仪器和试剂
1、材料 市售鲜虾肉 2、仪器 ① 层析柱（直径1.0-1.3 cm；管长30 cm) ② MC99-3自动液相色谱分离层析仪； ③ 核酸蛋白检测仪； ④ 自动部分收集器； ⑤ 分光光度计； ⑥ 低温高速离心机；
3、试剂 （1） 葡聚糖凝胶Sephadex G-100 （2） 精氨酸激酶提取液 （3） 凝胶层析柱平衡液 （4） 凝胶层析柱洗脱液 （5） 精氨酸激酶测定液
四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀 根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱 用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先 在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开 柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
六、仪器使用
组装蛋白质 纯化系统
整
2
体
蛋
白
质
纯
化
1
3
系
统
4 1：自动馏分收集器 2：梯度混合仪 3：恒流泵 4：核酸蛋白检测仪
各种层析柱
梯度混合仪
核酸蛋白检测仪
光吸收值显示
样品池
灵敏度选择
调光吸收0
调透过率100
部分收集器
当前收集管号显示
洗脱液出口 收集管
当设置键盘 收集时间显示
流速显示窗 流速调节旋钮
精氨酸激酶的提取、 分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料、仪器和试剂 • 实验操作步骤 • 仪器使用 • 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离 纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的 蛋白质的确定方法。
二、原理
凝胶过滤(Gel Fitration Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是 混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离 的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间 的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶 颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质 可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到 分离的目的。
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
• 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? • 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ • 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ • 4. 如何确定目的蛋白？ • 5. 如何评价蛋白质纯度？ • 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白
质 含量和活性？
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。 酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液， 立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时 停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一 个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
3. 加样 打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一 层，然后加入酶液，加样量一般不超过凝胶体积的5%。
4. 洗脱与收集 打开恒流泵，控制流速进行洗脱，洗脱液通过 核酸蛋白检测仪并通过自动收集器收集，每管收集2min。
5. 收集目的蛋白 通过测定每个蛋白峰的精氨酸激酶活性， 确定目的蛋白所在的峰，收集，可通过离子交换层析进一 步纯化，直至达到单一蛋白峰。
80
8
60
6
protein content enzymatic activity
40
0
20
40
60
tube number
酶活力测定体系
分别取储备液即57 mmol/L 精氨酸、46 mmol/L ATP、66 mmol/L MgSO4 和指示剂 (包含 0.15% g/ml百里酚蓝和 0.025% g/ml 甲酚红) 各2 ml 加水到20 ml，调至pH 8.0 （575 nm下的吸收值在2.1 左右）。
各种层析技术的主要原理
凝胶过滤层析
交联的葡聚糖凝胶
凝胶颗粒
凝胶颗粒内部的网状结构
表1 常用凝胶分离范围
凝胶类型及规格 葡聚糖凝胶 （ sephadex)
聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel ) 琼脂糖凝胶
（Sepharose）
G-200 G-100 G-50
G-25 P-300 P-150 2B 4B 6B
分离范围 6×105 1.5×105 3×104
5×103 5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105
精氨酸激酶活力测定(连续测活法)
精氨酸激酶催化精氨酸与ATP合成磷酸精氨酸 时释放出质子 。L-arginine+Mg•ATP
N-phospho-L-argine+Mg•ADP+H+ 用酸碱指示剂 (0.15 g/ml百里酚蓝和 0.025 g/ml 甲酚红) 指示溶液中质子生成的量，可表示精氨酸激 酶的活性。反应液的pH稍大于8.0时，其575 nm 处的吸光值下降（2.2~1.4范围内）与溶液中H+浓 度的增加成线性关系。 精氨酸激酶的活力用 A575/sec 表示。