《生物化学实验》PPT课件
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《生物化学》实验课件：实验三 组织匀浆的制备方法和琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察
• 常配成10%水溶液，2D（烘干）可抗凝5ml血液。 • ②肝素：常用Na盐或K盐，抗凝作用强，不影响细胞形态，对
血液化学分析干扰少。
• 肝素抗凝血不宜作血细胞培养，不宜作纤维蛋白原测定，作 DC时，染色性较差。作血液量元素分析时慎用。
• 一般配成1%水溶液，取0.5ml于试管，37～50℃烘干，可抗 凝5ml血液。
• 2．血液样品的区别 • ①血浆与血清的区别 • 血浆：抗凝采血后立即分离，含有纤维蛋原和前凝血酶 • 血清：血液凝固，血清析出后分离，不含纤维蛋原和前
凝血酶。 • ②全血一般用于血细胞分析，不宜作系列化分析。
生化分析一般用血清或血浆。
• 3．常用抗凝剂
• ①EDTA—Na2 ：能较好地保存血细胞成分，可得较纯的细胞 悬液。对血细胞形态影响很小，适于血细胞分析。
剪碎，
3-4ml 1/15mol/L Na2HPO4 1 g 猪心
匀浆
6-7ml, 1/15mol/L Na2HPO4
放置20min
2000r / min 上 清 液 离心10min （酶液）
细胞破碎
抽提
分离
2ห้องสมุดไป่ตู้ 琥珀酸脱氢酶的作用及酶竞争抑制作用的观察
试管号
1 2 3 4
心脏提取 琥珀酸钠 丙二酸钠 蒸馏水
实验器材与试剂:
（一）试剂 pH=7.4 磷酸缓冲液 1.5% 琥珀酸钠溶液 1% 丙二酸钠溶液 0.02% 甲烯蓝溶液 生理盐水 液体石蜡
实验器材与试剂：
（二）器材
研钵、手术剪、手术镊子 2 mL 移液管 1000 uL微量可调仪器 10 mL 离心管 低速离心机等
实验操作：
1. 琥珀酸脱氢酶酶液的制备
本实验设计在无氧的条件下使底物脱下来的氢交给氧化型的受氢体甲烯 蓝（蓝色）使之成为还原型受氢体甲烯白（无色），通过观察蓝色到无色的 变化从而了解脱氢酶的活性。
血液化学分析干扰少。
• 肝素抗凝血不宜作血细胞培养，不宜作纤维蛋白原测定，作 DC时，染色性较差。作血液量元素分析时慎用。
• 一般配成1%水溶液，取0.5ml于试管，37～50℃烘干，可抗 凝5ml血液。
• 2．血液样品的区别 • ①血浆与血清的区别 • 血浆：抗凝采血后立即分离，含有纤维蛋原和前凝血酶 • 血清：血液凝固，血清析出后分离，不含纤维蛋原和前
凝血酶。 • ②全血一般用于血细胞分析，不宜作系列化分析。
生化分析一般用血清或血浆。
• 3．常用抗凝剂
• ①EDTA—Na2 ：能较好地保存血细胞成分，可得较纯的细胞 悬液。对血细胞形态影响很小，适于血细胞分析。
剪碎，
3-4ml 1/15mol/L Na2HPO4 1 g 猪心
匀浆
6-7ml, 1/15mol/L Na2HPO4
放置20min
2000r / min 上 清 液 离心10min （酶液）
细胞破碎
抽提
分离
2ห้องสมุดไป่ตู้ 琥珀酸脱氢酶的作用及酶竞争抑制作用的观察
试管号
1 2 3 4
心脏提取 琥珀酸钠 丙二酸钠 蒸馏水
实验器材与试剂:
（一）试剂 pH=7.4 磷酸缓冲液 1.5% 琥珀酸钠溶液 1% 丙二酸钠溶液 0.02% 甲烯蓝溶液 生理盐水 液体石蜡
实验器材与试剂：
（二）器材
研钵、手术剪、手术镊子 2 mL 移液管 1000 uL微量可调仪器 10 mL 离心管 低速离心机等
实验操作：
1. 琥珀酸脱氢酶酶液的制备
本实验设计在无氧的条件下使底物脱下来的氢交给氧化型的受氢体甲烯 蓝（蓝色）使之成为还原型受氢体甲烯白（无色），通过观察蓝色到无色的 变化从而了解脱氢酶的活性。
生物化学实验课件西南科技大学生命科学与工程学院首页
操作步骤
1. 标准曲线的绘制
取 6 支试管，按下表 加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。以 蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
试剂
1
标准蛋白质 0 （ mL ）
蒸馏水量 1.00 （ mL ）
⒉相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种 离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同， 离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或 “数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以 在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
不同植物样品可溶性蛋白 含量和多肽组分的差异
实验目的
• 掌握冷冻离心机的操作使用方法。 • 掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。 • 掌握分光光度计的使用方法和原理。 • 掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。 • 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基
本操作过程。
实验包括三个部分内容： 一、不同植物样品可溶性蛋白的提取。 二、植物可溶性蛋白含量的测定。 三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。
C D E F
转速×时间 150g×20min 1000g×20min
内含物 完整细胞 细胞核，细胞碎片
3000g×6min
叶绿体
10000g×20min 线粒体、溶酶体、微体
100500g×20min 微粒体
100500g×20min 核糖体
＋0.26%脱氧胆酸
实验注意事项：
• 整个操作过程在0－4℃低温下进行； • 研磨必须充分；
生物化学检验ppt课件
酶类CK-MB,α-AMY等。
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、
底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA， UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，NH4+,CO2 等。
无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
吸收曲线
波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长(λ)为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘 制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长 λmax 和最小吸收波长λmin，在最大吸收波长处测定可获得最大的测 定灵敏度。
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
二、连续监测法
连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测 定和代谢物检测，多有酶的参与。该法是通过适当的 仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物 的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适 条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反 应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定 时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速 度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1） 绝对法：酶活力（U/L）=△A×（反应液体积/样品体 积）×（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力 （U/L）=〔 △A （测定）/ △A （标准） 〕标准物的 活力或浓度。
两点终点法
两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两 种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析 仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试 剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原 理是：加入样品→试剂1 →读取A1 →试剂2 →读取 A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样 品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色 反应，因此A=A1-A2。比浊法也是一种终点法，不过 是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化 学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊 法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种 蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、
生物化学实验ppt-new全
淀粉遇碘呈蓝色，是由于碘被吸附在淀粉上，形成一复合物， 此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其 他多糖大多能与碘呈特异的颜色，此类呈色物质也不稳定。
淀粉在酸催化下加热，逐渐水解成分子较小的糖，最后水解 成葡萄糖，其过程如下：淀粉--各种糊精—麦芽糖—葡萄糖。淀 粉完全水解后，失去与碘的作用，同时出现单糖的还原性。
五、操作
1、RNA的提取 称取5g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶
液30ml，沸水浴加热30min，经常搅拌。冷却，加入乙酸 数滴，使提取液呈酸性（PH5-6，用试纸试之），离心1015min（1000r/min）,取上清液，加入两倍体积的95%乙醇， 边加边搅拌。加毕，静置，待完全沉淀，离心5min （1000r/min），取沉淀物，沉淀物即为粗RNA，可作鉴 定和测定含量用。 2、鉴定
试剂
管号 0 1
2
4
6
2mg/ml卵清蛋白质/ml
0.0 0.3 0.6 1.2
1.8
蒸馏水/ml
3.0 2.7 2.4 1.8
1.2
双缩脲试剂/ml
2.0 2.0 2.0 2.0
2.0
充分混合，在540nm比色
蛋白质浓度/(mg/ml)
0.0 0.2 0.4 0.8
1.2
A540nm
需于显色后30min比色测定，30min后可能有雾状沉淀产生。各管由显色到比色的时间应尽 可能一致。
一、目的 掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
二、原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。
RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使 其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。
用碱液提取的RNA有不同程度的降解。
淀粉在酸催化下加热，逐渐水解成分子较小的糖，最后水解 成葡萄糖，其过程如下：淀粉--各种糊精—麦芽糖—葡萄糖。淀 粉完全水解后，失去与碘的作用，同时出现单糖的还原性。
五、操作
1、RNA的提取 称取5g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶
液30ml，沸水浴加热30min，经常搅拌。冷却，加入乙酸 数滴，使提取液呈酸性（PH5-6，用试纸试之），离心1015min（1000r/min）,取上清液，加入两倍体积的95%乙醇， 边加边搅拌。加毕，静置，待完全沉淀，离心5min （1000r/min），取沉淀物，沉淀物即为粗RNA，可作鉴 定和测定含量用。 2、鉴定
试剂
管号 0 1
2
4
6
2mg/ml卵清蛋白质/ml
0.0 0.3 0.6 1.2
1.8
蒸馏水/ml
3.0 2.7 2.4 1.8
1.2
双缩脲试剂/ml
2.0 2.0 2.0 2.0
2.0
充分混合，在540nm比色
蛋白质浓度/(mg/ml)
0.0 0.2 0.4 0.8
1.2
A540nm
需于显色后30min比色测定，30min后可能有雾状沉淀产生。各管由显色到比色的时间应尽 可能一致。
一、目的 掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
二、原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。
RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使 其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。
用碱液提取的RNA有不同程度的降解。
《生物化学实验》教学课件—23 酵母RNA的分离及组分鉴定
3、沉淀用95%乙醇洗2次，每次10mL搅拌沉 淀，离心，沉淀为粗RNA。 4、向上述含有RNA的离心管内加10%H2SO4 5mL，加热煮沸1~2min，将RNA水解。
生物化学实验技术
①核糖：取水解液0.5mL，加苔黑酚试剂1mL， 加热至沸1min，注意溶液是否变绿 ②嘌呤碱：取水解液2mL，加入氨水2滴及 5%AgNO31mL，观察是否有絮状嘌呤银化物 产生 ③磷酸：取水解液1mL，加入定磷试剂1mL， 观察溶液是否呈蓝色。
生物化学实验技术
酵母RNA的分离及 组分鉴定
实验类型： 验证性 教学时数：3
一、实验目的
1、掌握酵母RNA提取的方法。 2、了解核酸的组成。 3、掌握鉴定核酸组分的方法和操作。
生物化学实验技术
二、实验原理
酵母中RNA含量可达酵母干重的 2%~10%，DNA则少于0.5%。RNA可溶于碱 性溶液，用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解， 然后用酸中和，离心除去蛋白质和菌体后，上 清液用乙醇沉淀，由此可得RNA的粗制品。 RNA由核糖、碱基和磷酸组成，加入硫酸煮 沸后可使其水解，从水解液中可对上述组份进 行分别鉴定。
③嘌呤碱：嘌呤碱与AgNO3能产生白的嘌 呤银化物沉淀。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：三角瓶、沸水浴、量筒、滴管、试 管及试管架 、烧杯 、离心机。 2、试剂：0.2%NaOH氢氧化钠溶液，乙酸， 95%乙醇，10%硫酸溶液，浓氨水，5%硝酸 银溶液，苔黑酚（地衣酚）试剂，定磷试剂。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
①磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化成 无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷 酸铵（黄色沉淀）。当有还原剂存在时，磷酸 铵立即转变成蓝色的还原产物——钼蓝。
《生物化学实验》教学课件—08 蛋白质与氨基酸的显色反应
生物化学实验技术
（三）黄色反应 1、向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各 管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或微 火加热，待各管出现黄色后，于室温下逐滴加 入10%NaOH溶液溶液至碱，观察颜色变化。
生物化学实验技术
管号
材料 浓硝酸 （滴）
1 卵清蛋白
4滴
2
2 头发 少许
40
3 指甲 少许
40
生物化学实验技术
（二）茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄
色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和 茚三酮反应生成紫色物质，该反应十分灵敏， 目前广泛应用于氨基酸的定量测定。
生物化学实验技术
（三）黄色反应
含有苯环结构的氨基酸，遇浓硝酸后，可 被硝化成黄色的硝基酚，该化合物在碱性溶液 中进一步生成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质 分子都含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应。
生物化学实验技术
（二）茚三酮反应 1、取两支试管分别加入蛋白质溶液和Gly溶液 各1mL，再各加0.5 mL 0.1%茚三酮水溶液，混 匀，在沸水浴中加热1~2min，观察颜色由粉色 变紫红色再变蓝色。 2、在一小块滤纸上滴1滴0.5%的Gly溶液，风 干后，再在原处滴1滴0.1%茚三酮-乙醇溶液， 在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
生物化学实验技术
四、实验内容
（一）双缩脲反应 1、取少量尿素放在干燥的试管中，用微火加热 使尿素熔化，当熔化的尿素开始硬化时，停止 加热，尿素释放出氨气，形成双缩脲。冷却后， 加10%的NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加 1%的CuSO4溶液1滴再振荡，观察出现粉红色。
生物化学实验技术
2、再取另一试管加卵清蛋白溶液约1mL和10% 的NaOH溶液约2mL，摇匀，再加1%的CuSO4 溶液1~2滴再振荡，观察颜色变化，出现紫红色 示有蛋白质的存在。
（三）黄色反应 1、向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各 管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或微 火加热，待各管出现黄色后，于室温下逐滴加 入10%NaOH溶液溶液至碱，观察颜色变化。
生物化学实验技术
管号
材料 浓硝酸 （滴）
1 卵清蛋白
4滴
2
2 头发 少许
40
3 指甲 少许
40
生物化学实验技术
（二）茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄
色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和 茚三酮反应生成紫色物质，该反应十分灵敏， 目前广泛应用于氨基酸的定量测定。
生物化学实验技术
（三）黄色反应
含有苯环结构的氨基酸，遇浓硝酸后，可 被硝化成黄色的硝基酚，该化合物在碱性溶液 中进一步生成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质 分子都含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应。
生物化学实验技术
（二）茚三酮反应 1、取两支试管分别加入蛋白质溶液和Gly溶液 各1mL，再各加0.5 mL 0.1%茚三酮水溶液，混 匀，在沸水浴中加热1~2min，观察颜色由粉色 变紫红色再变蓝色。 2、在一小块滤纸上滴1滴0.5%的Gly溶液，风 干后，再在原处滴1滴0.1%茚三酮-乙醇溶液， 在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
生物化学实验技术
四、实验内容
（一）双缩脲反应 1、取少量尿素放在干燥的试管中，用微火加热 使尿素熔化，当熔化的尿素开始硬化时，停止 加热，尿素释放出氨气，形成双缩脲。冷却后， 加10%的NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加 1%的CuSO4溶液1滴再振荡，观察出现粉红色。
生物化学实验技术
2、再取另一试管加卵清蛋白溶液约1mL和10% 的NaOH溶液约2mL，摇匀，再加1%的CuSO4 溶液1~2滴再振荡，观察颜色变化，出现紫红色 示有蛋白质的存在。
《生物化学实验》教学课件—29 大蒜细胞SOD的提取与分离
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液， 光照一定时间后测定波长下各液光密度值，抑 制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范 围内呈正比。
以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光 还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出 二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相 对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光 还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活 力单位（U）。
生物化学实验技术
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负 离子，当加入NBT后，在光照条件下，与超 氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还 原生成蓝色的二甲月替。当加入SOD时，可 以使超氧自由基与H+结合生成H2O2 和O2，从 而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月 替生成速度减慢。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、实验材料：新鲜蒜瓣 2、仪器：恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可 见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒。 3、试剂：0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）， 氯仿-乙醇混合液，丙酮，0.05mol/L碳酸盐缓 冲液（pH10.2），0.1mol/LEDTA溶液， 2mmol/L肾上腺素溶液。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化 50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：
酶活力（单位）=2（A-B）N/A 式中，N——样品稀释倍数；2——抑制肾 上腺素自氧化50%的换算系数。
生物化学实验技术
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙 醇混合液搅拌15min，5000 rpm离心15min， 得到的上清液为粗酶液。 4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的 冷丙酮，搅拌15min，5000 rpm离心15min， 得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸 缓冲液（pH7.8）中，于55~60℃热处理15min， 得到SOD酶液。
生物化学实验课件
• 操作：
• 用醋酸和醋酸钠配制成各种不同pH值的缓冲液。向 诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液 的pH值即为酪蛋白的等电点。
PPT学习交流
12
二、蛋白质的沉淀反应
• 原理：
• 蛋白质是一类高分子化合物，分子大小已达胶体颗粒范 围（1~100毫微米）,因此蛋白质在水溶液中具有胶体 的性质。维持蛋白质胶体稳定的因素有两个：一是胶体 颗粒所带的电荷，一是与介质水形成的水化膜。这种稳 定性是有条件的、相对的，在一定物理化学因素影响下， 蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素， 从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。
PPT学习交流
18
实验内容
• （一） 血清γ—球蛋白的分离纯化
• 1．硫酸铵盐析 ：注意应缓慢滴入饱和硫酸铵溶液 并边加边摇，避免局部浓度过高。
• 2．透析脱盐：用纳氏试剂检查水中NH4+，直至硫酸 铵全部透析完毕。
• 3．DEAE—纤维素柱层析：装柱、平衡柱床、上样、 洗脱收集。
• 4．检查洗脱液中蛋白质：磺基水杨酸检查，出现白
• 本法多用于测定糖原含量，也可用于测定葡萄糖含 量。
PPT学习交流
4
实验内容与结果
• 1、制作葡萄糖标准曲线 • 2、测定样品含糖量 • 计算100克小麦面粉中总糖含量
PPT学习交流
5
实验二
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验要求
• 学习分配层析法的原理 • 掌握氨基酸纸上层析的操作技术（包括点样、平衡、
生物化学实验
任课教师：李遂焰
实验一
总糖的测定——蒽酮比色法
实验要求
• 掌握蒽酮比色定糖法的原理和方法 • 掌握72型分光光度计的原理和操作方法 • 学习通过制作标准曲线测定未知物含量的方法
• 用醋酸和醋酸钠配制成各种不同pH值的缓冲液。向 诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液 的pH值即为酪蛋白的等电点。
PPT学习交流
12
二、蛋白质的沉淀反应
• 原理：
• 蛋白质是一类高分子化合物，分子大小已达胶体颗粒范 围（1~100毫微米）,因此蛋白质在水溶液中具有胶体 的性质。维持蛋白质胶体稳定的因素有两个：一是胶体 颗粒所带的电荷，一是与介质水形成的水化膜。这种稳 定性是有条件的、相对的，在一定物理化学因素影响下， 蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素， 从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。
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18
实验内容
• （一） 血清γ—球蛋白的分离纯化
• 1．硫酸铵盐析 ：注意应缓慢滴入饱和硫酸铵溶液 并边加边摇，避免局部浓度过高。
• 2．透析脱盐：用纳氏试剂检查水中NH4+，直至硫酸 铵全部透析完毕。
• 3．DEAE—纤维素柱层析：装柱、平衡柱床、上样、 洗脱收集。
• 4．检查洗脱液中蛋白质：磺基水杨酸检查，出现白
• 本法多用于测定糖原含量，也可用于测定葡萄糖含 量。
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4
实验内容与结果
• 1、制作葡萄糖标准曲线 • 2、测定样品含糖量 • 计算100克小麦面粉中总糖含量
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5
实验二
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验要求
• 学习分配层析法的原理 • 掌握氨基酸纸上层析的操作技术（包括点样、平衡、
生物化学实验
任课教师：李遂焰
实验一
总糖的测定——蒽酮比色法
实验要求
• 掌握蒽酮比色定糖法的原理和方法 • 掌握72型分光光度计的原理和操作方法 • 学习通过制作标准曲线测定未知物含量的方法
《生物化学实验》教学课件—01 糖的呈色反应和定性鉴定
生物化学实验技术
四、实验内容
（一）莫式反应 于4支试管中分别加入1mL 1%葡萄糖溶液、
1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素，然 后各加莫式试剂2滴，摇匀。将试管倾斜，沿 管壁慢慢加入1.5mL浓硫酸（切勿振摇！）， 硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察 液面交界处有无紫色环出现。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
（三）杜式反应 戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与
间苯三酚结合成樱桃红色物质。 （四）班式反应
柠檬酸钠和Cu2+生成络离子，此络离子与 葡萄糖中的醛基反应生成红黄色沉淀。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：水浴锅，试管，胶头滴管。 2、试剂： 莫式试剂，塞式试剂，杜式试剂， 班式试剂，1%葡萄糖溶液，1%蔗糖溶液， 1%淀粉溶液，1%果糖溶液，1%半乳糖溶液， 1%阿拉伯糖溶液，浓硫酸。
生物化学实验技术
糖的呈色反应和 定性鉴定
实验类型验证性 教学时数：6
一、实验目的
1、掌握莫式（Molisch）反应鉴定糖的原理和 方法。
2、掌握塞式（Seliwanoff）反应鉴定酮糖的原 理和方法。
3、掌握杜式（Tollen）反应鉴定酮糖的原理和 方法。
4、掌握班式（Benedict）反应鉴定还原性糖的 原理和方法。
（二）塞式反应 于4支试管中，分别加入0.5mL 1%葡萄糖
溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加 塞式试剂2.5mL，摇匀，同时置沸水浴内，比 较各管颜色及红色出现的先后顺序。
生物化学实验技术
（三）杜式反应 于3支试管中加入杜式试剂1mL，再分别
加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1% 阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴 中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。
四、实验内容
（一）莫式反应 于4支试管中分别加入1mL 1%葡萄糖溶液、
1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素，然 后各加莫式试剂2滴，摇匀。将试管倾斜，沿 管壁慢慢加入1.5mL浓硫酸（切勿振摇！）， 硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察 液面交界处有无紫色环出现。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
（三）杜式反应 戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与
间苯三酚结合成樱桃红色物质。 （四）班式反应
柠檬酸钠和Cu2+生成络离子，此络离子与 葡萄糖中的醛基反应生成红黄色沉淀。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：水浴锅，试管，胶头滴管。 2、试剂： 莫式试剂，塞式试剂，杜式试剂， 班式试剂，1%葡萄糖溶液，1%蔗糖溶液， 1%淀粉溶液，1%果糖溶液，1%半乳糖溶液， 1%阿拉伯糖溶液，浓硫酸。
生物化学实验技术
糖的呈色反应和 定性鉴定
实验类型验证性 教学时数：6
一、实验目的
1、掌握莫式（Molisch）反应鉴定糖的原理和 方法。
2、掌握塞式（Seliwanoff）反应鉴定酮糖的原 理和方法。
3、掌握杜式（Tollen）反应鉴定酮糖的原理和 方法。
4、掌握班式（Benedict）反应鉴定还原性糖的 原理和方法。
（二）塞式反应 于4支试管中，分别加入0.5mL 1%葡萄糖
溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加 塞式试剂2.5mL，摇匀，同时置沸水浴内，比 较各管颜色及红色出现的先后顺序。
生物化学实验技术
（三）杜式反应 于3支试管中加入杜式试剂1mL，再分别
加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1% 阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴 中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。
生物化学实验 PPT课件
电位梯度的不连续性
E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/(电导率)
E与电泳速度成正比
电泳开始后，由于快离子泳动 率最大，在快离子后面形成一 个离子浓度低的低电导区，产 生较高的电位梯度，使蛋白质 和慢离子加速移动，蛋白质样 品被进一步浓缩。
A. 样品的浓缩效应
四个不连续性造成样品浓缩效应原 理包括：
蛋白质样品被夹在中间。
缓冲液
样品 浓缩胶
分离胶
缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效 应示意图
快离子 慢离子 蛋白质
样品
电位梯度的不连续性
E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/(电导率)
E与电泳速度成正比
电泳开始后，由于快离子泳动 率最大，在快离子后面形成一 个离子浓度低的低电导区，产 生较高的电位梯度，使蛋白质 和慢离子加速移动，蛋白质样 品被进一步浓缩。
五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理
3.聚丙烯酰胺凝胶的孔径
凝胶越浓T，凝胶孔径↓，所受阻力，机械强度
丙稀酰胺浓度
分离物质分子量
4％
大于100万
7－7.5％
1－100万
15－30％
小于1万
胶的孔径为蛋白质分子平均大小一半时效果好
凝胶强度的选择
先用7.5%的标准凝胶或4%--10%的凝胶梯度测试
生物化学实验biochemicalexperiment实验基本知识容量瓶液体的量取液体的倾倒滴管的使用试纸的使用一定质量分数的溶液的配制滤纸的折叠物质分离与提纯过滤萃取与分液实验内容安排共36学时1绪论时生物化学实验规则及常用仪器使用入门2学2实验一纸层析分离鉴定氨基酸6学时3实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳4学时4实验三蛋白质的颜色反应2学时5实验四蛋白质的沉淀变性反应3学时6实验五凝胶过滤法除蛋白质中的离子4学时7实验六酵母rna的提取和鉴定4学时8实验七血糖含量的测定4学时9实验八脂肪酸的氧化5学时10实验报告讲解及考核2学时1实验目的?掌握蛋白质酶核酸糖等重要物质的分离纯化和测定技术的原理及方法
《生物化学实验》教学课件—35 血液中转氨酶活力的测定
生物化学实验技术
生物化学实验技术
α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合， 生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光 谱与丙酸酮二硝基苯稍有差别，在520m波长 比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较 丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转 氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加， 因此在波长520m处吸光度增加的程度与反应 体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本上呈 线性关系，故可藉以测定谷丙转氨酶的活力。
3、酮体的测定
（1）另取2只50mL锥形瓶，按下表编号后加 入有关试剂。加完试剂后摇匀，放置10min。
编号
滤液1
I（实验） 2.0 II（对照） --
试剂（mL）
滤液2
0.1mol/L 10%NaO
H2O
碘溶液 H溶液
--
--
3.0
3.0
2.0
--
3.0
3.0
生物化学实验技术
在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数（用 1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力），计算每 100mL血清中转氨酶的活力单位数。
混匀后，37℃水浴20min
0.4mol/L NaOH溶液/mL
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
混匀后，室温放置10min，以0号管作空白，在505nm比色
丙酮酸的μmol数（横坐标） 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
A505nm（纵坐标）
生物化学实验技术
2、另取2支试管，按下表进行操作。
生物化学实验技术
本实验以丙氨酸及α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶 （GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛 作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮 酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼 结合，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液 中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm，可用于 测定丙酮酸含量。
生物化学实验技术
α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合， 生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光 谱与丙酸酮二硝基苯稍有差别，在520m波长 比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较 丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转 氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加， 因此在波长520m处吸光度增加的程度与反应 体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本上呈 线性关系，故可藉以测定谷丙转氨酶的活力。
3、酮体的测定
（1）另取2只50mL锥形瓶，按下表编号后加 入有关试剂。加完试剂后摇匀，放置10min。
编号
滤液1
I（实验） 2.0 II（对照） --
试剂（mL）
滤液2
0.1mol/L 10%NaO
H2O
碘溶液 H溶液
--
--
3.0
3.0
2.0
--
3.0
3.0
生物化学实验技术
在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数（用 1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力），计算每 100mL血清中转氨酶的活力单位数。
混匀后，37℃水浴20min
0.4mol/L NaOH溶液/mL
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
混匀后，室温放置10min，以0号管作空白，在505nm比色
丙酮酸的μmol数（横坐标） 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
A505nm（纵坐标）
生物化学实验技术
2、另取2支试管，按下表进行操作。
生物化学实验技术
本实验以丙氨酸及α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶 （GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛 作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮 酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼 结合，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液 中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm，可用于 测定丙酮酸含量。
《生物化学实验》教学课件—16 蛋白质的定量测定-Folin-酚法
生物化学实验技术
蛋白质的定量测定—— Folin-酚法
实验类型：综合性 教学时数：6
一、实验目的
1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理。 2、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的方法。
生物化学实验技术
二、实验原理
在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu2+结 合，生成紫红色络合物。 Folin-酚试剂中的磷 钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨 酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合 物）。在一定的浓度范围内，蓝色的深浅与蛋 白质的含量成正比。
此法可检测的最低蛋白质量达5μg。通常 测定范围是20～250μg。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、材料：200μg/mL人血清或蛋清 2、仪器：可见光分光光度计、恒温水浴锅、 旋涡混合器、计时器、试管、试管架、移液 管。 3、试剂：试剂甲，试剂乙，250μg/mL标准 蛋白质溶液，0.9%生理盐水。
2、样品测定
取4支干净的刻度试管，编号，按照下表 加入试剂。
试剂
试管编号
1
2
3
4
V（待测蛋白质溶液）/mL —
1.0
1.0
1.0
V（0.9%生理盐水）/mL 1.0
—
—
—
生物化学实验技术
向各管内分别加入新鲜配制的试剂甲2mL， 混匀，室温放置10min。再加入试剂乙0.20mL， 2s内迅速混匀！
40℃水浴10min后，冷却至室温。以1号试 管作空白对照，测定各管的吸光度值A500nm。 在标准曲线上分别查出其相当于标准蛋白的量， 计算3个平行样品中蛋白质浓度的平均值。
生物化学实验技术
生物化学实验技术支干净的刻度试管，编号，按照下表加 入试剂。
蛋白质的定量测定—— Folin-酚法
实验类型：综合性 教学时数：6
一、实验目的
1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理。 2、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的方法。
生物化学实验技术
二、实验原理
在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu2+结 合，生成紫红色络合物。 Folin-酚试剂中的磷 钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨 酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合 物）。在一定的浓度范围内，蓝色的深浅与蛋 白质的含量成正比。
此法可检测的最低蛋白质量达5μg。通常 测定范围是20～250μg。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、材料：200μg/mL人血清或蛋清 2、仪器：可见光分光光度计、恒温水浴锅、 旋涡混合器、计时器、试管、试管架、移液 管。 3、试剂：试剂甲，试剂乙，250μg/mL标准 蛋白质溶液，0.9%生理盐水。
2、样品测定
取4支干净的刻度试管，编号，按照下表 加入试剂。
试剂
试管编号
1
2
3
4
V（待测蛋白质溶液）/mL —
1.0
1.0
1.0
V（0.9%生理盐水）/mL 1.0
—
—
—
生物化学实验技术
向各管内分别加入新鲜配制的试剂甲2mL， 混匀，室温放置10min。再加入试剂乙0.20mL， 2s内迅速混匀！
40℃水浴10min后，冷却至室温。以1号试 管作空白对照，测定各管的吸光度值A500nm。 在标准曲线上分别查出其相当于标准蛋白的量， 计算3个平行样品中蛋白质浓度的平均值。
生物化学实验技术
生物化学实验技术支干净的刻度试管，编号，按照下表加 入试剂。
《生物化学实验》教学课件—22 核酸的定量测定-定糖法
生物化学实验技术
核酸的定量测定—— 定糖法（地衣酚法）
实验类型： 验证性 教学时数：3
一、实验目的
学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地 衣酚法）的原理和操作技术
生物化学实验技术
二、实验原理
核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解， 形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3,5-二羟 基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用 三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在 670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200 μg/mL范围内，吸光度与RNA的浓度成正比关 系。
生物化学实验技术
地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核 糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各 不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种 RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来 源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从 曲线求得被测样品的RNA含量。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：试管及管架 、水浴锅 、移液管、 可见光分光光度计。 2、试剂：RNA标准溶液，RNA样品溶液， 0.1%地衣酚试剂。
时的取样毫升数，求得有机磷的质量浓度（μg/mL）。 按下式计算样品中核酸的质量分数：
CV × 11 W = m × 100%
W：核酸的质量分数（％）； C：有机磷的质量浓度（μg/mL）； V：样品总体积（mL）； 11：因核酸中含磷量为9％左右，1μg磷相当于11μg核酸； M：样品质量（μg）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
×
100%
生物化学实验技术
3、无机磷的测定 吸取样液（2mg/mL）1.0mL，置于
100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取 3.0mL置试管中，加定磷试剂3.0mL，45℃水 浴中保温10min，测A660nm。
核酸的定量测定—— 定糖法（地衣酚法）
实验类型： 验证性 教学时数：3
一、实验目的
学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地 衣酚法）的原理和操作技术
生物化学实验技术
二、实验原理
核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解， 形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3,5-二羟 基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用 三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在 670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200 μg/mL范围内，吸光度与RNA的浓度成正比关 系。
生物化学实验技术
地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核 糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各 不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种 RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来 源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从 曲线求得被测样品的RNA含量。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：试管及管架 、水浴锅 、移液管、 可见光分光光度计。 2、试剂：RNA标准溶液，RNA样品溶液， 0.1%地衣酚试剂。
时的取样毫升数，求得有机磷的质量浓度（μg/mL）。 按下式计算样品中核酸的质量分数：
CV × 11 W = m × 100%
W：核酸的质量分数（％）； C：有机磷的质量浓度（μg/mL）； V：样品总体积（mL）； 11：因核酸中含磷量为9％左右，1μg磷相当于11μg核酸； M：样品质量（μg）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
×
100%
生物化学实验技术
3、无机磷的测定 吸取样液（2mg/mL）1.0mL，置于
100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取 3.0mL置试管中，加定磷试剂3.0mL，45℃水 浴中保温10min，测A660nm。
《生物化学实验》教学课件—30 还原性维生素C的定量测定
生物化学实பைடு நூலகம்技术
四、实验内容
1、提取：称取新鲜样品约4g，置于研钵中， 加入5mL 2%草酸溶液研磨成浆状，残渣再 次研磨，一同转入50mL容量瓶中，草酸总 量为35mL，加水定容。 2、过滤：提取液充分混匀后，离心，过滤。
生物化学实验技术
3、样品滴定：准确吸取滤液5 mL于50mL的锥 形瓶中，立即用标定过的2,6-二氯酚靛酚溶液 滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用 染料的毫升数（重复测定2~3次）。
生物化学实验技术
因此，可用2,6-二氯酚靛酚滴定样品中的 还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化后， 稍多加一些染料，使滴定液呈淡红色，即为终 点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的 标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量 呈正比。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、材料：新鲜蔬菜水果 2、仪器：研钵，天平，容量瓶，量筒，刻度 吸管，锥形瓶，微量滴定管，漏斗，新鲜蔬 菜或新鲜水果，滤纸，离心机。 3、试剂：2%草酸溶液，标准维生素C溶液， 0.02% 2,6-二氯酚靛酚溶液。
生物化学实验技术
还原性维生素C的 定量测定
实验类型：验证性 教学时数：3
一、实验目的
掌握2,6-二氯酚靛酚滴定法测定维生素C 的原理和方法。
生物化学实验技术
二、实验原理
维生素C具有很强的还原性，还原型抗坏 血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚钠盐，本身则 氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2,6-二 氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。
4、空白滴定：准确量取35mL 2%的草酸，放 入50mL容量瓶中，加水定容。准确吸5 mL于 50mL的锥形瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚溶液 滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用 染料的毫升数（重复测定2~3次）。
四、实验内容
1、提取：称取新鲜样品约4g，置于研钵中， 加入5mL 2%草酸溶液研磨成浆状，残渣再 次研磨，一同转入50mL容量瓶中，草酸总 量为35mL，加水定容。 2、过滤：提取液充分混匀后，离心，过滤。
生物化学实验技术
3、样品滴定：准确吸取滤液5 mL于50mL的锥 形瓶中，立即用标定过的2,6-二氯酚靛酚溶液 滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用 染料的毫升数（重复测定2~3次）。
生物化学实验技术
因此，可用2,6-二氯酚靛酚滴定样品中的 还原型抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化后， 稍多加一些染料，使滴定液呈淡红色，即为终 点。如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的 标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量 呈正比。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、材料：新鲜蔬菜水果 2、仪器：研钵，天平，容量瓶，量筒，刻度 吸管，锥形瓶，微量滴定管，漏斗，新鲜蔬 菜或新鲜水果，滤纸，离心机。 3、试剂：2%草酸溶液，标准维生素C溶液， 0.02% 2,6-二氯酚靛酚溶液。
生物化学实验技术
还原性维生素C的 定量测定
实验类型：验证性 教学时数：3
一、实验目的
掌握2,6-二氯酚靛酚滴定法测定维生素C 的原理和方法。
生物化学实验技术
二、实验原理
维生素C具有很强的还原性，还原型抗坏 血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚钠盐，本身则 氧化成脱氢抗坏血酸。在酸性溶液中，2,6-二 氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。
4、空白滴定：准确量取35mL 2%的草酸，放 入50mL容量瓶中，加水定容。准确吸5 mL于 50mL的锥形瓶中，立即用2,6-二氯酚靛酚溶液 滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用 染料的毫升数（重复测定2~3次）。
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掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术， 尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加 科研工作打下坚实的基础。
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24
3 实验记录与实验报告
3.1 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上
设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量 的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为 “0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽 可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差 很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、 编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试 剂的浓度等。
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25
3 实验记录与实验报告
3.2 实验报告
实验报告的格式应为：
⑴ 实验目的；
⑵ 实验原理；
⑶ 仪器、材料和试剂；
⑷ 实验步骤；
⑸ 结果讨论（含数理据处）；
⑹ 注意事项;
(7) 思考题
注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有 关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化 学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析 和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
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35
（2）离子交换层析
原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固 定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。
常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交 联剂：二乙烯苯）
阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+
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21
7、实验六 酵母RNA的提取和鉴定 (4学时) 8、实验七 血糖含量的测定 （4学时） 9、实验八 脂肪酸的β-氧化 （5学时） 10、实验报告讲解及考核 （2学时）编辑ppt22绪论1 实验目的
掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、 纯化和测定技术的原理及方法；
掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实 验技能；
编辑ppt
30
1、层析技术原理
层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合 物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分 以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相， 另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不 同速度移动，从而达到分离的目的。
可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。
编辑ppt
31
2、层析技术分类
生物化学实验
Biochemical Experiment
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1
实验基本知识
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2
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3
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4
编辑ppt
5
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6
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7
容量瓶
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8
液体的量取
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9
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10
液体的倾倒
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11
滴管的使用
编辑ppt
12
试纸的使用
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13
培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学 作风、创新能力等综合素质。
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23
2 通过生物化学实验应该做到
学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验 的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合 理地安排实验步骤和时间。
训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生 物化学实验仪器。
学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能， 提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进 行所有的实验。
80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50 年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、 凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。
几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化 高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。
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29
一、层析技术
1、层析技术原理 2、层析技术分类 3、常用层析技术原理
名称
操作方式
固定相 流动相 分离依据
分配层析
纸层析 薄层层析
离子交换层析 离子交换柱层析
吸附层析 亲合层析
吸附薄层层析 气体吸附层析 酶与底物 抗原与抗体
液体
固体 固体 固体 固体
液体 溶解度
液体
液体 气体
带电性 静电引力
吸附力
液体 配体专一性
凝胶层析
凝胶过滤
固体
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液体 分子大小
32
3、常用的层析原理
30
16 32
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40
8
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4
12
2
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纸层析
纸层析是最简单的液一液相分配层析。
滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时， 大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此， 纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相 混溶的有机溶剂为层析的流动相。
对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定 的温度条件下，Rf是个常数。
（1）分配层析——纸层析
原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同， 在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，
即分配系数（α）。
α =
固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度
固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）
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48
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阴离子：Cl-、OH-
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示意图（交换树脂表面）
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示意图（离子交换过程）
电离基团（磺酸根） 可交换离子（钠离子） 交换离子 不交换离子
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示意图
B物质
编辑p水pt 分子
A物3质9
（3）吸附层析
原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面 时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸 附现象。
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15
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16
一定质量分数的溶液的配制
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17
滤纸的折叠
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物质分离与提纯－－过滤
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19
萃取与分液
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实验内容安排
共36学时 1、绪论 生物化学实验规则及常用仪器使用入门（2学时） 2、实验一 纸层析分离鉴定氨基酸 （6学时） 3、实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （4学时） 4、实验三 蛋白质的颜色反应 （2学时） 5、实验四 蛋白质的沉淀、变性反应 （3学时） 6、实验五 凝胶过滤法除蛋白质中的离子 （4学时）
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26
4 实验成绩评分方法
实验预习情况（10%） 实验操作情况（20%） 实验报告情况（70%）
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27
生物化学实验技术理论 层析技术
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28
一、层析技术
1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶 中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色 谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原 因．又常称为层析法。
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24
3 实验记录与实验报告
3.1 实验记录 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上
设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量 的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为 “0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽 可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差 很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、 编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试 剂的浓度等。
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25
3 实验记录与实验报告
3.2 实验报告
实验报告的格式应为：
⑴ 实验目的；
⑵ 实验原理；
⑶ 仪器、材料和试剂；
⑷ 实验步骤；
⑸ 结果讨论（含数理据处）；
⑹ 注意事项;
(7) 思考题
注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有 关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化 学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析 和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
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（2）离子交换层析
原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固 定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。
常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交 联剂：二乙烯苯）
阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 可交换离子：阳离子：Na+、H+
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7、实验六 酵母RNA的提取和鉴定 (4学时) 8、实验七 血糖含量的测定 （4学时） 9、实验八 脂肪酸的β-氧化 （5学时） 10、实验报告讲解及考核 （2学时）编辑ppt22绪论1 实验目的
掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、 纯化和测定技术的原理及方法；
掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实 验技能；
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30
1、层析技术原理
层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合 物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分 以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相， 另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不 同速度移动，从而达到分离的目的。
可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。
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31
2、层析技术分类
生物化学实验
Biochemical Experiment
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1
实验基本知识
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2
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3
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4
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5
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6
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7
容量瓶
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8
液体的量取
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9
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10
液体的倾倒
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11
滴管的使用
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12
试纸的使用
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培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学 作风、创新能力等综合素质。
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2 通过生物化学实验应该做到
学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验 的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合 理地安排实验步骤和时间。
训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生 物化学实验仪器。
学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能， 提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进 行所有的实验。
80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50 年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、 凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。
几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化 高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。
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一、层析技术
1、层析技术原理 2、层析技术分类 3、常用层析技术原理
名称
操作方式
固定相 流动相 分离依据
分配层析
纸层析 薄层层析
离子交换层析 离子交换柱层析
吸附层析 亲合层析
吸附薄层层析 气体吸附层析 酶与底物 抗原与抗体
液体
固体 固体 固体 固体
液体 溶解度
液体
液体 气体
带电性 静电引力
吸附力
液体 配体专一性
凝胶层析
凝胶过滤
固体
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液体 分子大小
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3、常用的层析原理
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16 32
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纸层析
纸层析是最简单的液一液相分配层析。
滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时， 大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此， 纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相 混溶的有机溶剂为层析的流动相。
对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定 的温度条件下，Rf是个常数。
（1）分配层析——纸层析
原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同， 在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，
即分配系数（α）。
α =
固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度
固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）
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阴离子：Cl-、OH-
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示意图（交换树脂表面）
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示意图（离子交换过程）
电离基团（磺酸根） 可交换离子（钠离子） 交换离子 不交换离子
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示意图
B物质
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A物3质9
（3）吸附层析
原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面 时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸 附现象。
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一定质量分数的溶液的配制
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滤纸的折叠
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物质分离与提纯－－过滤
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萃取与分液
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实验内容安排
共36学时 1、绪论 生物化学实验规则及常用仪器使用入门（2学时） 2、实验一 纸层析分离鉴定氨基酸 （6学时） 3、实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （4学时） 4、实验三 蛋白质的颜色反应 （2学时） 5、实验四 蛋白质的沉淀、变性反应 （3学时） 6、实验五 凝胶过滤法除蛋白质中的离子 （4学时）
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4 实验成绩评分方法
实验预习情况（10%） 实验操作情况（20%） 实验报告情况（70%）
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生物化学实验技术理论 层析技术
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一、层析技术
1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶 中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色 谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原 因．又常称为层析法。