第五章、噬菌体和粘粒载体
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基因至少有 61 个，其中有一半参与生命周期的活动，称为必须基 因；另一部分基因为非必须基因。 溶源周期中整合在染色体DNA上(λ作为克隆载体的重要特性)。 其它优点： 研究历史悠久； 寄主范围较质粒狭窄，更加安全； λ噬菌体DNA两端具有由 12个核着酸组成的粘性末端，可用来 构建质粒类载体。
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基因工程
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
（３）λ噬菌体载体的主要类型
插入型载体
外源的DNA克隆到插入型的人载体分子上，会使噬菌体的某 种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。根据插入失 活效应的特异性，插入型的人载体又可以进一步区分为免疫 功能失活的和大肠杆菌ß 半乳糖苷酶失活的两种。
基因工程
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
5.1.２.２ 噬菌体的溶源生命周期
感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬 菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上， 成为它的一个组成部分。
只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。
①温和噬菌体： ②溶源性细菌：整合有一套完整的噬菌体基因组 的细菌。
③溶源化：用温和噬菌体感染细菌使之形成溶源 性细菌的过程。
感染免疫性。 第二，经过许多世代之后，溶源性细菌便能够开始进入溶菌周期，
这一过程叫溶源性细菌的诱发。在诱发过程中，噬菌体基因组以单
一DNA片段的形式从寄主染色体DNA上删除下来。
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λ噬菌体的超感染免疫性现象--阻遏一操纵体系
阻遏基因 cI 编码的阻遏蛋白，与两 个分别同启动基因PL、PR相邻的操 纵基因OL和OR结合。
基因工程
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②开半乳糖苷酶失活的插入型载体 基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ 区段
lacZ 指示菌：lac一 培养基：IPTG和Xgal
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基因工程
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
替换型载体
又叫做取代型载体：提高克隆外源DNA片段的能力。
凯伦噬菌体载体
的一种特殊的噬菌体载体。
凯伦噬菌体是 F．R．Blattner等人于 1977年在λ噬菌体基础上发展出来
凯伦（ Charon）是古希腊神话中的一位老摆渡工，专司在斯蒂克斯河 （River Styx）上运送亡灵到阴间。所以 Blattner形象地称自己所构建的 噬菌体为凯伦载体。
这类载体有插入型的，如凯伦2；也有替换型的，如凯伦30。
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基因工程
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
超感染的λ噬菌体DNA将会发生什么样的变化呢？ 这种DNA可形成超盘旋的结构，由于处在超盘旋结构状
态的λDNA复制基因很难进行复制，而细菌细胞却没有受
到影响，仍能正常地生长和分裂，结果经过若干世代之 后，在细菌细胞群体中，感染的DNA分子便逐渐地被稀
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基因工程 5.2.4 λ噬茵体载体的改良
基因工程 具体过程：
（1）尾部末端吸附；
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
（2）通过尾轴把DNA全部注入到细 胞，蛋白质外壳则留在胞外；
（3）噬菌体的DNA在细菌体内合成自
身DNA和蛋白质； （4）新合成DNA与蛋白质组装子代噬 菌体； （5）细菌的解体,子代噬菌体释放。
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(1)red和gam控制DNA的重组作用，在感
染的早期使寄主 RecBC 蛋白质失去功能
（ RecBC 蛋白质是一种多功能的核酸酶， 它具有核酸内切酶和核酸外切酶活性）。
(2)xis和int基因 (3)N和Q编码抗终止因子，分别控制早期功能和晚期功能的调节； (4)cI基因编码的蛋白质是一种阻遏物；cro蛋白也是一种阻遏物，能同 操纵基因OL和OR结合而抑制转录
M．Thomas等人（1974）:替换型载体 AgtAc，可取代片段 含有att、int及xis三个基因。 野生型载体可以处于稳定的溶源状态，并能产生出混浊型的 噬菌斑。 重组体载体失去了整合作用的功能，不能进入溶源状态，产 生出清晰型的噬菌斑。
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基因工程 5.1.2 .5 λ附着位点att
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
λDNA 整 合 在染 色 体 上的位 点 叫做λ附着位点att. 大多数的温和噬菌体都整合在 特定位置上。少数一些噬菌体可 整合在数个位点上，甚至染色体 的任何一个位点上。
整合酶: 由λ基因int编码,能够识
基因工程 第五章、噬菌体和粘粒载体 第一节 噬菌体的一般生物学特性 第二节 λ噬菌体载体 第三节 柯斯质粒载体 第四节 单链噬菌体载体 第五节 噬菌粒载体
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基因工程
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
第一节 噬菌体的一般生物学特性 5.1.1.1 结构及核酸
噬菌体颗粒基本类型:无尾二十面体型、 具尾二十面体型和线状体型。 噬菌体的核酸，最常见的是双链线性 DNA。除此之外，还发现有双链环形
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基因工程
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（2）筛选失去固有EcoRI 位点的λ突变体的办法
将噬菌体感染到具有EcoRI 限制一修饰体系和不具有EcoRI限制一修 饰体系的两种寄主细胞中循环生长。 将得到的完全失去 EcoRI 位点的λ，同野生λ在体内进行杂交，然后选 择仅具有1-2个限制位点重组体噬菌体。
④原噬菌体：在溶源性细菌内存在的整合的或非 整合的噬菌体DNA。
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基因工程
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5.1.2.1 溶源周期的主要特征
已知存在两种不同类型的溶源周期，其中最普遍的一种是以λ噬菌体 为原型，具有如下特性： ①噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 ②短暂的转录期之后，合成一种整合酶，之后转录活性便被一种阻 遏物所关闭。
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基因工程 5.1.2.2 超感染免疫性
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
溶源性细菌有两个重要特点： 第一，溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体
感染。溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体感染的性质，叫超
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基因工程 5.2.2 λ噬菌体DNA的复制
早期，按式复制
晚期，滚环复制。 受 λgam 基因产物控制， 抑 制 RecBC 酶 ( 内 、 外 切 酶)
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gam+ 的噬菌体只能产生
出多连体的DNA分子， gam - 噬 菌 体 只 能 产 生 出 单体分子。
许多Charon噬菌体载体，都带有编码着从半乳糖苦酶基因以及它的操纵
基因和启动子的laeＺ取代区段。
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用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：
第一，核酸内切酶消化载体，
除去可取代的DNA区段。
第二，λ DNA臂同外源 DNA 片段连接。 第三，重组体的 DNA 分子进 行包装和增殖，得到有感染性 的λ重组噬菌体。
λDNA首先环化，然后通过在两个 别 λDNA 和细菌 DNA 的附着位点， att物理性的破裂，并进行准确的噬 菌体DNA和寄主DNA的再接合，从 并能催化这两种 DNA之间发生链 而发生整合作用 的交换。
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基因工程
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疑问--插入之后为何不马上删除呢？
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基因工程 5.2.1基因组结构
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
基因除了两个正调节基因N和Q之外， 其余的是按功能成簇 :头部、尾部、复 制及重组四大功能基因簇。 为叙述方便，往往划分为三个区域：
左侧区：包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成 所需要的全部基因； 中间区：又称为非必要区，包括一些与重组有关的基因 （例如redA和redB），以及int基因，和xis 基因。 右侧区：包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因 以及溶菌基因G和R。 西北师范大学 精品课程 武国凡
DNA、 单 链 环 形 DNA、 单 链 线 性
DNA以及单链RNA等多种形式。
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基因工程 5.1.1.2 噬菌体的感染性
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
少量噬菌体感染高浓度寄主细胞后，涂板，结果在平板上， 以最初被感染的细胞为中心，形成大量的噬菌斑。
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基因工程 5.1.2.4 溶源噬菌体的诱发
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
溶源性细菌中的阻遏基因处于失活状态时，操纵基因就将
是自由的，转录就会正常启动，诱发噬菌体进入裂解途径。 噬菌体的诱发还需要合成一种叫做删除酶的噬菌体产物。 删除酶的功能是将原噬菌体 DNA 从细菌染色体 DNA 上删 除下来，而后环化成环形的DNA分子。。
阻遏物能够持续地合成，产量就其操纵基因而言是略为超量的。 由于阻遏物同OL和OR结合，PL和PR这两个早期启动子开始的转录 被抑制的。使原噬菌体保持“关闭”的形式，这就是溶源性细菌能够不 停地生长而不发生溶菌裂解的原因。 同时，后进入的同类噬菌体由于PL和PR被抑制，无法溶原化。称这 种抑制作用同源免疫超感染抗性。
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5.2.3 λ噬茵体载体的构建及其主要类型 （1）构建λ噬菌体载体的基本原理 消去多余的限制位点和非必要的区段:
野生型的 λ，有过多的限制位点，例如有 5 个 EcoRI 的限制
位点和7个Hindlll的限制位点。
所以说，构建λ载体的基本原理是多余限制位点的删除。
删除应该比插入更容易发生，因为此 时两个附着位点都是存在于同一 DNA分子上。 实际上：整合与删除不是同一过程。
其原因是整合后的位点是杂合的。
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第二节 λ噬菌体载体
研究得最为详尽，双链DNA，分子量31×106，48502bp;中等大小， 温和噬菌体。
释掉了。
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基因工程 5.1.2.3 异源免疫性
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
有些温和噬菌体，如噬菌体 21 和 434 ，各自具有自身的 免疫体系，具有自身的阻遏基因和操纵基因。因此，其阻 遏物不能同λ的操纵基因结合；反过来，λ的阻遏物，也不 能够同21和434 噬菌体的操纵基因结合。这样的一对噬菌 体，互称为异源免疫性。 温和噬菌体可以在异源免疫性的溶源性细菌的菌苔上形 成噬菌斑。 噬菌体DNA的免疫性区段（包括cI基因、操纵基因和启 动基因），以imm表示，如immλ、imm21和imm434等。
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①免疫功能失活的插入型载体：
基因组中有一段免疫区 imm
当外源DNA插入时，合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源
周期。
imm
重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就 会形成混浊的噬菌斑。
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③噬菌体DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。
④细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进 行复制。
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基因工程
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
另一种类型的溶源周期是以噬菌体PI为原型，较为少见， 其基本特征是不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系， 而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。
基因工程 ５.1.２噬菌体的生命周期
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5.1.２.１ 噬茵体的溶菌生命周期
裂解寄主细胞，释放子代噬菌 体的生命周期
只具有溶菌生长周期的噬菌体 叫做烈性噬菌体。
溶菌生长周期之间的共同特征：
1 吸附： 2 注入： 3 转变： 4 合 成：5 组装：6 释放：
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（３）λ噬菌体载体的主要类型
插入型载体
外源的DNA克隆到插入型的人载体分子上，会使噬菌体的某 种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。根据插入失 活效应的特异性，插入型的人载体又可以进一步区分为免疫 功能失活的和大肠杆菌ß 半乳糖苷酶失活的两种。
基因工程
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5.1.２.２ 噬菌体的溶源生命周期
感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬 菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上， 成为它的一个组成部分。
只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。
①温和噬菌体： ②溶源性细菌：整合有一套完整的噬菌体基因组 的细菌。
③溶源化：用温和噬菌体感染细菌使之形成溶源 性细菌的过程。
感染免疫性。 第二，经过许多世代之后，溶源性细菌便能够开始进入溶菌周期，
这一过程叫溶源性细菌的诱发。在诱发过程中，噬菌体基因组以单
一DNA片段的形式从寄主染色体DNA上删除下来。
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λ噬菌体的超感染免疫性现象--阻遏一操纵体系
阻遏基因 cI 编码的阻遏蛋白，与两 个分别同启动基因PL、PR相邻的操 纵基因OL和OR结合。
基因工程
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②开半乳糖苷酶失活的插入型载体 基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ 区段
lacZ 指示菌：lac一 培养基：IPTG和Xgal
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替换型载体
又叫做取代型载体：提高克隆外源DNA片段的能力。
凯伦噬菌体载体
的一种特殊的噬菌体载体。
凯伦噬菌体是 F．R．Blattner等人于 1977年在λ噬菌体基础上发展出来
凯伦（ Charon）是古希腊神话中的一位老摆渡工，专司在斯蒂克斯河 （River Styx）上运送亡灵到阴间。所以 Blattner形象地称自己所构建的 噬菌体为凯伦载体。
这类载体有插入型的，如凯伦2；也有替换型的，如凯伦30。
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超感染的λ噬菌体DNA将会发生什么样的变化呢？ 这种DNA可形成超盘旋的结构，由于处在超盘旋结构状
态的λDNA复制基因很难进行复制，而细菌细胞却没有受
到影响，仍能正常地生长和分裂，结果经过若干世代之 后，在细菌细胞群体中，感染的DNA分子便逐渐地被稀
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基因工程 5.2.4 λ噬茵体载体的改良
基因工程 具体过程：
（1）尾部末端吸附；
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（2）通过尾轴把DNA全部注入到细 胞，蛋白质外壳则留在胞外；
（3）噬菌体的DNA在细菌体内合成自
身DNA和蛋白质； （4）新合成DNA与蛋白质组装子代噬 菌体； （5）细菌的解体,子代噬菌体释放。
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(1)red和gam控制DNA的重组作用，在感
染的早期使寄主 RecBC 蛋白质失去功能
（ RecBC 蛋白质是一种多功能的核酸酶， 它具有核酸内切酶和核酸外切酶活性）。
(2)xis和int基因 (3)N和Q编码抗终止因子，分别控制早期功能和晚期功能的调节； (4)cI基因编码的蛋白质是一种阻遏物；cro蛋白也是一种阻遏物，能同 操纵基因OL和OR结合而抑制转录
M．Thomas等人（1974）:替换型载体 AgtAc，可取代片段 含有att、int及xis三个基因。 野生型载体可以处于稳定的溶源状态，并能产生出混浊型的 噬菌斑。 重组体载体失去了整合作用的功能，不能进入溶源状态，产 生出清晰型的噬菌斑。
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基因工程 5.1.2 .5 λ附着位点att
第五章、噬菌体和粘粒载体 返回第五章
λDNA 整 合 在染 色 体 上的位 点 叫做λ附着位点att. 大多数的温和噬菌体都整合在 特定位置上。少数一些噬菌体可 整合在数个位点上，甚至染色体 的任何一个位点上。
整合酶: 由λ基因int编码,能够识
基因工程 第五章、噬菌体和粘粒载体 第一节 噬菌体的一般生物学特性 第二节 λ噬菌体载体 第三节 柯斯质粒载体 第四节 单链噬菌体载体 第五节 噬菌粒载体
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第一节 噬菌体的一般生物学特性 5.1.1.1 结构及核酸
噬菌体颗粒基本类型:无尾二十面体型、 具尾二十面体型和线状体型。 噬菌体的核酸，最常见的是双链线性 DNA。除此之外，还发现有双链环形
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（2）筛选失去固有EcoRI 位点的λ突变体的办法
将噬菌体感染到具有EcoRI 限制一修饰体系和不具有EcoRI限制一修 饰体系的两种寄主细胞中循环生长。 将得到的完全失去 EcoRI 位点的λ，同野生λ在体内进行杂交，然后选 择仅具有1-2个限制位点重组体噬菌体。
④原噬菌体：在溶源性细菌内存在的整合的或非 整合的噬菌体DNA。
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5.1.2.1 溶源周期的主要特征
已知存在两种不同类型的溶源周期，其中最普遍的一种是以λ噬菌体 为原型，具有如下特性： ①噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 ②短暂的转录期之后，合成一种整合酶，之后转录活性便被一种阻 遏物所关闭。
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基因工程 5.1.2.2 超感染免疫性
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溶源性细菌有两个重要特点： 第一，溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体
感染。溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体感染的性质，叫超
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基因工程 5.2.2 λ噬菌体DNA的复制
早期，按式复制
晚期，滚环复制。 受 λgam 基因产物控制， 抑 制 RecBC 酶 ( 内 、 外 切 酶)
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gam+ 的噬菌体只能产生
出多连体的DNA分子， gam - 噬 菌 体 只 能 产 生 出 单体分子。
许多Charon噬菌体载体，都带有编码着从半乳糖苦酶基因以及它的操纵
基因和启动子的laeＺ取代区段。
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用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：
第一，核酸内切酶消化载体，
除去可取代的DNA区段。
第二，λ DNA臂同外源 DNA 片段连接。 第三，重组体的 DNA 分子进 行包装和增殖，得到有感染性 的λ重组噬菌体。
λDNA首先环化，然后通过在两个 别 λDNA 和细菌 DNA 的附着位点， att物理性的破裂，并进行准确的噬 菌体DNA和寄主DNA的再接合，从 并能催化这两种 DNA之间发生链 而发生整合作用 的交换。
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基因工程
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疑问--插入之后为何不马上删除呢？
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基因工程 5.2.1基因组结构
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基因除了两个正调节基因N和Q之外， 其余的是按功能成簇 :头部、尾部、复 制及重组四大功能基因簇。 为叙述方便，往往划分为三个区域：
左侧区：包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成 所需要的全部基因； 中间区：又称为非必要区，包括一些与重组有关的基因 （例如redA和redB），以及int基因，和xis 基因。 右侧区：包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因 以及溶菌基因G和R。 西北师范大学 精品课程 武国凡
DNA、 单 链 环 形 DNA、 单 链 线 性
DNA以及单链RNA等多种形式。
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基因工程 5.1.1.2 噬菌体的感染性
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少量噬菌体感染高浓度寄主细胞后，涂板，结果在平板上， 以最初被感染的细胞为中心，形成大量的噬菌斑。
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基因工程 5.1.2.4 溶源噬菌体的诱发
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溶源性细菌中的阻遏基因处于失活状态时，操纵基因就将
是自由的，转录就会正常启动，诱发噬菌体进入裂解途径。 噬菌体的诱发还需要合成一种叫做删除酶的噬菌体产物。 删除酶的功能是将原噬菌体 DNA 从细菌染色体 DNA 上删 除下来，而后环化成环形的DNA分子。。
阻遏物能够持续地合成，产量就其操纵基因而言是略为超量的。 由于阻遏物同OL和OR结合，PL和PR这两个早期启动子开始的转录 被抑制的。使原噬菌体保持“关闭”的形式，这就是溶源性细菌能够不 停地生长而不发生溶菌裂解的原因。 同时，后进入的同类噬菌体由于PL和PR被抑制，无法溶原化。称这 种抑制作用同源免疫超感染抗性。
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5.2.3 λ噬茵体载体的构建及其主要类型 （1）构建λ噬菌体载体的基本原理 消去多余的限制位点和非必要的区段:
野生型的 λ，有过多的限制位点，例如有 5 个 EcoRI 的限制
位点和7个Hindlll的限制位点。
所以说，构建λ载体的基本原理是多余限制位点的删除。
删除应该比插入更容易发生，因为此 时两个附着位点都是存在于同一 DNA分子上。 实际上：整合与删除不是同一过程。
其原因是整合后的位点是杂合的。
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第二节 λ噬菌体载体
研究得最为详尽，双链DNA，分子量31×106，48502bp;中等大小， 温和噬菌体。
释掉了。
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有些温和噬菌体，如噬菌体 21 和 434 ，各自具有自身的 免疫体系，具有自身的阻遏基因和操纵基因。因此，其阻 遏物不能同λ的操纵基因结合；反过来，λ的阻遏物，也不 能够同21和434 噬菌体的操纵基因结合。这样的一对噬菌 体，互称为异源免疫性。 温和噬菌体可以在异源免疫性的溶源性细菌的菌苔上形 成噬菌斑。 噬菌体DNA的免疫性区段（包括cI基因、操纵基因和启 动基因），以imm表示，如immλ、imm21和imm434等。
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①免疫功能失活的插入型载体：
基因组中有一段免疫区 imm
当外源DNA插入时，合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源
周期。
imm
重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就 会形成混浊的噬菌斑。
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③噬菌体DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。
④细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进 行复制。
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另一种类型的溶源周期是以噬菌体PI为原型，较为少见， 其基本特征是不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系， 而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。
基因工程 ５.1.２噬菌体的生命周期
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5.1.２.１ 噬茵体的溶菌生命周期
裂解寄主细胞，释放子代噬菌 体的生命周期
只具有溶菌生长周期的噬菌体 叫做烈性噬菌体。
溶菌生长周期之间的共同特征：
1 吸附： 2 注入： 3 转变： 4 合 成：5 组装：6 释放：
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