第五章噬菌体载体和柯斯载体
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入溶源生命周期。 • 溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组
的细菌 • 溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之
形成溶源性细菌的过程
2020/8/12
• 整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞 染色体DNA中
• 原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或 非整合的噬菌体
• 超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一 次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染 。
2020/8/12
back
•λ 噬 菌 体 分 子 量 31×106dal，中等大 小的温和噬菌体，目 前已经定位61个基因， 其中一半参与了生命 周期，为必要基因； 余下的为非必要基因。
溶菌阶段
(复制和释放)
2020/8/12
溶源阶段
(整合寄主染色体)
一、λ噬菌体的分子生物学概述 λ phage
② 溶源噬菌体的诱发 • 依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。
阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌 体转录。 • 需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染 色体上删除下来，使之形成环形的DNA分 子，恢复溶源周期开始时的状态。
2020/8/12
Hif
整合酶必须首先与宿主编码的宿主整合因子(host integration factor，Hif)结合形 成复202合0/8体/12，才能催化 attP和 attB在O区进行重组而形成原噬菌体。
• 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期 • 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 • 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
2020/8/12
四、噬菌体的溶源生命周期 • 溶源生长周期：是指在感染过程中没有产
生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一 个组成部分。 • 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源 周期
2020/8/12
1、概念 • 温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进
2020/8/12
一、 噬菌体的结构和其核酸类型 结构：无尾部结构的二十面体型、
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、
双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。
2020/8/12
2020/8/12
• 不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是 比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较 复杂；对寄主的依赖性较低
菌周期，称为溶源性诱发。
2020/8/12
① 超敏感免疫性
• 阻遏－操纵体系：cⅠ基因编码阻遏蛋白，启 动子PL和PR，操纵基因OL和OR
cⅠ PL OL
OR PR
• 阻遏蛋白同操纵基因结合使RNA聚合酶不能起 始转录，这种状态有充分的能力使原噬菌体保 持“关闭”形式，溶源细菌能够正常生长。
2020/8/12
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2、溶源周期的主要特征
• λ噬菌体和P1噬菌体 • λ噬菌体的特征： (1) 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 (2) 经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于
是转录活性便被一种阻遏物所关闭 (3) 噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA
上，变成原噬菌体 (4) 细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染
2020/8/12
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本章主要内容
• 噬菌体一般特性 • λ噬菌体 • 柯斯质粒 • M13噬菌体 1、M13噬菌体特性及基因组结构 2、M13噬菌体载体类型及特点 噬菌粒
2020/8/12
比较
第一节 噬菌体的一般生物学特性（
Bacteriophage，phage）
• 噬菌体可以在脱离寄主 细胞的状态下保持生命， 但一旦脱离了寄主细胞， 就不能生长和复制 • 利用寄主的核糖体、蛋 白质合成因子、氨基酸 和产能体系，进行生长 和繁殖
五、重组噬菌体的分离
•大肠杆菌培养至对数生长期 • 加入λ噬菌体悬浮液，37℃培养1小时 • 用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时 • 高速离心，沉淀噬菌体 • 苯酚抽提，释放λ-DNA • 乙醇或异丙醇沉淀DNA。
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back
第二节 λ噬菌体载体
1、λ噬菌体特性及基因组结构 2、λ噬菌体载体类型及特点
感染高浓度细菌
在未发生第一次裂解 前涂布平板
2020/8/12
2020/8/12
• 噬菌体的感染过程
尾部粘至细胞壁
尾部蛋白质收缩
核酸注入细菌
利用细菌的RNA聚合 酶和核糖体翻译得到 噬菌体蛋白
2020/8/12
合成头部尾部蛋白 进行组装
合成自身的DNA 至数百个拷贝
使细菌的DNA降解
三、噬菌体的溶菌生命周期
2020/8/12
• 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 • 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：
1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭
环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体
系，从而生长出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒
1、基因组结构 （1）cos位点 • 线性双链DNA分子两端各有一条12nt组成的 彼此完全互补的5’突出单链 • 注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成 为cos位点。
色体的一部分进行复制。
2020/8/12
2020/8/12
• 噬菌体P1基本特征： 不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而 是变成了一种进行独立复制的环形的质粒 DNA分子。
2020/8/12
3、超感染免疫性
（1）溶源细菌的两个重要特点： • 不能被头一次感染的噬菌体再次感染，称为
超感染免疫性； • 经过许多世代以后，溶源性细菌可以进入溶
• 有 些 噬 菌 体 的 DNA 碱 基 不 是 由 标 准 的 A/T/C/G组成的。 Example：
T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞
嘧啶（HMC）；SP01噬菌体DNA中没有T碱基， 取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。
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二、噬菌体的感染性 噬菌斑形成
噬菌体
的细菌 • 溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之
形成溶源性细菌的过程
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• 整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞 染色体DNA中
• 原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或 非整合的噬菌体
• 超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一 次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染 。
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•λ 噬 菌 体 分 子 量 31×106dal，中等大 小的温和噬菌体，目 前已经定位61个基因， 其中一半参与了生命 周期，为必要基因； 余下的为非必要基因。
溶菌阶段
(复制和释放)
2020/8/12
溶源阶段
(整合寄主染色体)
一、λ噬菌体的分子生物学概述 λ phage
② 溶源噬菌体的诱发 • 依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。
阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌 体转录。 • 需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染 色体上删除下来，使之形成环形的DNA分 子，恢复溶源周期开始时的状态。
2020/8/12
Hif
整合酶必须首先与宿主编码的宿主整合因子(host integration factor，Hif)结合形 成复202合0/8体/12，才能催化 attP和 attB在O区进行重组而形成原噬菌体。
• 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期 • 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 • 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
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四、噬菌体的溶源生命周期 • 溶源生长周期：是指在感染过程中没有产
生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一 个组成部分。 • 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源 周期
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1、概念 • 温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进
2020/8/12
一、 噬菌体的结构和其核酸类型 结构：无尾部结构的二十面体型、
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、
双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。
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2020/8/12
• 不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是 比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较 复杂；对寄主的依赖性较低
菌周期，称为溶源性诱发。
2020/8/12
① 超敏感免疫性
• 阻遏－操纵体系：cⅠ基因编码阻遏蛋白，启 动子PL和PR，操纵基因OL和OR
cⅠ PL OL
OR PR
• 阻遏蛋白同操纵基因结合使RNA聚合酶不能起 始转录，这种状态有充分的能力使原噬菌体保 持“关闭”形式，溶源细菌能够正常生长。
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2、溶源周期的主要特征
• λ噬菌体和P1噬菌体 • λ噬菌体的特征： (1) 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 (2) 经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于
是转录活性便被一种阻遏物所关闭 (3) 噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA
上，变成原噬菌体 (4) 细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染
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本章主要内容
• 噬菌体一般特性 • λ噬菌体 • 柯斯质粒 • M13噬菌体 1、M13噬菌体特性及基因组结构 2、M13噬菌体载体类型及特点 噬菌粒
2020/8/12
比较
第一节 噬菌体的一般生物学特性（
Bacteriophage，phage）
• 噬菌体可以在脱离寄主 细胞的状态下保持生命， 但一旦脱离了寄主细胞， 就不能生长和复制 • 利用寄主的核糖体、蛋 白质合成因子、氨基酸 和产能体系，进行生长 和繁殖
五、重组噬菌体的分离
•大肠杆菌培养至对数生长期 • 加入λ噬菌体悬浮液，37℃培养1小时 • 用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时 • 高速离心，沉淀噬菌体 • 苯酚抽提，释放λ-DNA • 乙醇或异丙醇沉淀DNA。
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第二节 λ噬菌体载体
1、λ噬菌体特性及基因组结构 2、λ噬菌体载体类型及特点
感染高浓度细菌
在未发生第一次裂解 前涂布平板
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2020/8/12
• 噬菌体的感染过程
尾部粘至细胞壁
尾部蛋白质收缩
核酸注入细菌
利用细菌的RNA聚合 酶和核糖体翻译得到 噬菌体蛋白
2020/8/12
合成头部尾部蛋白 进行组装
合成自身的DNA 至数百个拷贝
使细菌的DNA降解
三、噬菌体的溶菌生命周期
2020/8/12
• 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 • 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：
1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭
环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体
系，从而生长出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒
1、基因组结构 （1）cos位点 • 线性双链DNA分子两端各有一条12nt组成的 彼此完全互补的5’突出单链 • 注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成 为cos位点。
色体的一部分进行复制。
2020/8/12
2020/8/12
• 噬菌体P1基本特征： 不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而 是变成了一种进行独立复制的环形的质粒 DNA分子。
2020/8/12
3、超感染免疫性
（1）溶源细菌的两个重要特点： • 不能被头一次感染的噬菌体再次感染，称为
超感染免疫性； • 经过许多世代以后，溶源性细菌可以进入溶
• 有 些 噬 菌 体 的 DNA 碱 基 不 是 由 标 准 的 A/T/C/G组成的。 Example：
T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞
嘧啶（HMC）；SP01噬菌体DNA中没有T碱基， 取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。
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二、噬菌体的感染性 噬菌斑形成
噬菌体