12第五章 噬菌体载体

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（2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λDNA分子按θ 形式从双向进行复制。


到了晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了， 合成出由一系列线性排列的λ基因组DNA组成的 长多连体分子。 多连体分子经过核酸酶的切割作用，从cos位点 将它分离成单体分子之后，才能够包装。
(242页)
4. 噬菌体的溶源生命周期

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温和噬菌体感染寄主细胞之后出现的溶源周期中， 不会产生出子代噬菌体颗粒，寄主的细菌细胞仍 然存活着并继续进行细胞分裂。 经过了许多世代之后，如果环境条件正常的话， 溶源周期便会终止，重新开始溶菌生命周期。


寄主细菌会因裂解而致死，释放出许多子代噬菌 体颗粒。
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β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：

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这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其 中有编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ。 这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在加有IPTG 和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。 如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖苷酶 基因lacZ的编码序列，那么由这种λ重组体感染的lac-指 示菌，由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬 菌斑。 如使用大肠杆菌Lac+指示菌，无论有无外源DNA插入， 都形成蓝色噬菌斑。 可以应用Xgal-IPTG显色技术检测转化子。


DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。(张)
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λ噬菌体：

作为基因克隆载体的一个重要特性： 由外源基因取代非必要基因所形成的重组 噬菌体DNA，可以随着寄主大肠杆菌细胞 一道复制和增殖，而且在其溶源周期中， 它们的DNA是整合在大肠杆菌的染色体 DNA上，成为后者的一个组成部分。
第五章 噬菌体载体和柯斯载体
第一节 噬菌体的一般生物学特性 第二节 λ噬菌体载体 第三节 柯斯质粒载体 第四节 单链DNA噬菌体载体 第五节 噬菌粒载体 —————————— 克隆外源DNA的能力： * 质粒：15 kb左右； * λ噬菌体：25 kb左右； * 柯斯载体：45 kb左右。
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2. 噬菌体的感染性
噬菌体对寄主细胞的感染作用： 烈性噬菌体的生命周期： 噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上 ↓ DNA注入到被感染的细菌细胞 ↓ 噬菌体DNA复制 ↓ 合成出新的头部及尾部蛋白质 ↓ 组装成子代噬菌体颗粒 ↓ 寄主细胞壁被破坏并发生溶菌 ↓ 释放出子代噬菌体颗粒
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噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高 特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合
入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两
种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它
们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；
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3. 噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为： 溶菌周期。 溶源周期。 两种类型的噬菌体： 烈性噬菌体：只有溶菌周期。 温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。
(242页)
3. 噬菌体的溶菌生命周期 基本过程为：
（1）吸附：噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。 （2）注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。 （3）转变：被感染的细菌成为制造噬菌体颗粒的场所。 （4）合成：功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核 酸和蛋白质。 （5）组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。 （6）释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放 出来。
（在包装进蛋白质外壳之前， λDNA在cos位点切开成线性）
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λ噬菌体基因组的பைடு நூலகம்个区域

左侧区：包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白 质合成所需要的全部基因。
中间区：又称为非必要区。包括与重组以及使噬 菌体整合到大肠杆菌染色体中去的int基因，和 把原噬菌体从寄主染色体上删除下来的xis基因。 右侧区：包括全部主要的调控成份，噬菌体的复 制基因以及溶菌基因。
(248页)
第二节 λ噬菌体载体

(248页)
λ噬菌体： * 分子量为31 x 106 dal。 * 中等大小的温和噬菌体。 * 已定位的基因至少有61个。 一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。 另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影 响噬菌体的生命功能。 人们可以根据需要改变 l-DNA 或宿主细胞的性质，使 噬菌体或处于溶源状态，或处于溶菌状态。（张)
(243页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）： （1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 （2）经过短暂的转录。 （3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。 （4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
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1. λ噬菌体的分子生物学概述
(249页)
（1）基因组的结构： 碱基对数：48502。 cos位点：线性双链DNA分子的两端各有一条由12个核 苷酸组成的彼此完全互补的5’单链突出序列，即粘性末 端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子， 会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成双链 DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5’P和3’-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。由这种 粘性末端结合形成的双链区称为cos位点。 cos位点： λ噬菌体线性双链DNA分子的两端各12个完 全互补的核苷酸粘性末端结合形成的双链区。
234页



噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
Xgal-IPTG显色反应（285页）


具有功能活性的β-半乳糖苷酶是四聚体。 Xgal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) ：无色化合物。 β-半乳糖苷酶能将无色的Xgal切割成半乳糖和深蓝色的 底物5-溴-4-氯靛蓝。因此，Xgal可作为检测β-半乳糖苷 酶的一种指示剂。 IPTG：一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的 条件下，它可以诱导细胞合成β-半乳糖苷酶。 称IPTG为β-半乳糖苷酶的安慰诱导物。 乳糖诱导物IPTG（372页）
(255页)

插入型载体：只能承受较小分子量(一般在 10kb以内)的外源DNA片段的插入，广泛用 于cDNA及小片段DNA的克隆。
替换型载体：可承受较大分子量的外源 DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生 物的染色体。

（2）λ噬菌体载体的主要类型 Ⅰ、插入型载体： 插入失活效应：外源的DNA 克隆到插入型的λ噬 菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧 失效力。 免疫功能失活的插入型载体：在基因组的免疫区 中插入外源DNA片段，载体所具有的合成活性 阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。 只能形成清晰的噬菌斑。 * 有外源DNA插入：清晰的噬菌斑。 * 没有外源DNA插入：亲本噬菌体可以进入溶源 状态，形成浑浊的噬菌斑。 β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：（下页）
(刘志国，102-105页）
1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 常用作基因工程的噬菌体： ◆双链噬菌体：λ噬菌体。 * 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多 种克隆载体。 *目前常用的有： EMBL系列、 λgt系列、 Charon系列。 ◆单链噬菌体：M13噬菌体。
2. 噬菌体的感染性

(240页)
1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 噬菌体的核酸： 最常见的是：双链线性DNA。 还有双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。 有些噬菌体DNA碱基不是由标准的A、T、 C、G四种碱基组成。 如T4噬菌体DNA中没有C，取代的是5-羟甲 基胞嘧啶（HMC）。
自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
第一节 噬菌体的一般生物学特性
噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。 1. 噬菌体的结构及其核酸类型： * 一般分为三种类型： 无尾部结构的二十面体型。 具尾部结构的二十面体型。 线状体型。 * 大多数噬菌体都属于第二种类型。

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(241页)
(241页)
一个噬菌体颗粒 → 感染一个细菌细胞 → 迅速形成数百个子代噬菌体颗粒 → 每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞 → 再产生出数百个子代颗粒。

如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便 能够使数十亿个的细菌细胞致死。 噬菌斑：感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下 的空斑。 菌苔（lawn）：覆盖培养基表面的单层细菌。
Ⅰ、若干基本概念

234页

噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
(244页)
4. 噬菌体的溶源生命周期


另一种类型的溶源周期是以噬菌体T1为原 型。比较少见。 基本特征是：不存在噬菌体DNA分子的整 合作用体系，而是变成了一种进行独立复 制的环形的质粒DNA分子。
4. 噬菌体的溶源生命周期
(245页)
Ⅲ、超感染免疫性： 溶源性细菌有两个重要特点： （1）超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次 感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性 这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染 免疫性。 （2）溶源性细菌的诱发：经过许多世代之后，溶 源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。
在电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域如一只眼睛（张玉静，101）
（张玉静，141）
（张玉静，141）
2. λ噬菌体载体的构建及其主要类型
(253页)
（1）构建的基本原理：野生型λ噬菌体DNA，一 种酶的酶切位点多。不适合作基因克隆的载体。 基本原理：删除多余限制位点。 构建的λ噬菌体的派生载体： * 插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的 克隆位点。也有一些具有两个克隆位点，但彼此 靠近。 * 替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个 位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片 段所取代。
(英含遗工词)


(241页)
2. 噬菌体的感染性



将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并 在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之 前，将此培养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内， 头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌 体颗粒。 由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌 体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感 染周期。 此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置 为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大 量的噬菌斑。

基因工程又称重组DNA技术 其实施至少要有四个必要的条件 1. 工具酶 2. 基因 3. 载体 4. 受体细胞

（《基因工程..》静国忠，85页）
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噬菌体定义： 是一类细菌病毒的总称。 噬菌体与质粒的区别 * 质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分 子。 * 噬菌体：DNA分子除了复制起点之外，还有编 码外壳蛋白质的基因。
5. 重组噬菌体的分离
外源DNA片段 + 噬菌体DNA分子 ↓ 重组的噬菌体DNA分子感染寄主细胞 ↓ 用32P标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交 ↓ 获得阳性克隆 ↓ 分离大量的重组体噬菌体DNA， 实现克隆基因的扩增
(247页)
(247页)
5. 重组噬菌体的分离
接种针粘取噬菌体颗粒
↓ 新鲜的细菌培养基中 ↓ 在细胞内大量增殖 ↓ 氯化铯密度梯度离心 （噬菌体介于纯DNA与纯蛋白质之间） ↓ 纯化重组体噬菌体DNA