12第五章 噬菌体载体

1. λ噬菌体的分子生物学概述
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（1）基因组的结构： 碱基对数：48502。 cos位点：线性双链DNA分子的两端各有一条由12个核 苷酸组成的彼此完全互补的5’单链突出序列，即粘性末 端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子， 会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成双链 DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5’P和3’-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。由这种 粘性末端结合形成的双链区称为cos位点。 cos位点： λ噬菌体线性双链DNA分子的两端各12个完 全互补的核苷酸粘性末端结合形成的双链区。
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1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 噬菌体的核酸： 最常见的是：双链线性DNA。 还有双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。 有些噬菌体DNA碱基不是由标准的A、T、 C、G四种碱基组成。 如T4噬菌体DNA中没有C，取代的是5-羟甲 基胞嘧啶（HMC）。
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第二节 λ噬菌体载体

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λ噬菌体： * 分子量为31 x 106 dal。 * 中等大小的温和噬菌体。 * 已定位的基因至少有61个。 一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。 另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影 响噬菌体的生命功能。 人们可以根据需要改变 l-DNA 或宿主细胞的性质，使 噬菌体或处于溶源状态，或处于溶菌状态。（张)
在电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域如一只眼睛（张玉静，101）
（张玉静，141）
（张玉静，141）
2. λ噬菌体载体的构建及其主要类型
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（1）构建的基本原理：野生型λ噬菌体DNA，一 种酶的酶切位点多。不适合作基因克隆的载体。 基本原理：删除多余限制位点。 构建的λ噬菌体的派生载体： * 插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的 克隆位点。也有一些具有两个克隆位点，但彼此 靠近。 * 替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个 位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片 段所取代。
5. 重组噬菌体的分离
外源DNA片段 + 噬菌体DNA分子 ↓ 重组的噬菌体DNA分子感染寄主细胞 ↓ 用32P标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交 ↓ 获得阳性克隆 ↓ 分离大量的重组体噬菌体DNA， 实现克隆基因的扩增
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(247页)
5. 重组噬菌体的分离
接种针粘取噬菌体颗粒
↓ 新鲜的细菌培养基中 ↓ 在细胞内大量增殖 ↓ 氯化铯密度梯度离心 （噬菌体介于纯DNA与纯蛋白质之间） ↓ 纯化重组体噬菌体DNA


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（2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λDNA分子按θ 形式从双向进行复制。


到了晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了， 合成出由一系列线性排列的λ基因组DNA组成的 长多连体分子。 多连体分子经过核酸酶的切割作用，从cos位点 将它分离成单体分子之后，才能够包装。
(英含遗工词)


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2. 噬菌体的感染性



将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并 在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之 前，将此培养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内， 头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌 体颗粒。 由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌 体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感 染周期。 此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置 为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大 量的噬菌斑。

噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高 特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合
入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两
种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它
们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；
2. 噬菌体的感染性
噬菌体对寄主细胞的感染作用： 烈性噬菌体的生命周期： 噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上 ↓ DNA注入到被感染的细菌细胞 ↓ 噬菌体DNA复制 ↓ 合成出新的头部及尾部蛋白质 ↓ 组装成子代噬菌体颗粒 ↓ 寄主细胞壁被破坏并发生溶菌 ↓ 释放出子代噬菌体颗粒
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4. 噬菌体的溶源生命周期
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）： （1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 （2）经过短暂的转录。 （3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。 （4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
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自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
第一节 噬菌体的一般生物学特性
噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。 1. 噬菌体的结构及其核酸类型： * 一般分为三种类型： 无尾部结构的二十面体型。 具尾部结构的二十面体型。 线状体型。 * 大多数噬菌体都属于第二种类型。

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基因工程又称重组DNA技术 其实施至少要有四个必要的条件 1. 工具酶 2. 基因 3. 载体 4. 受体细胞

（《基因工程..》静国忠，85页）
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噬菌体定义： 是一类细菌病毒的总称。 噬菌体与质粒的区别 * 质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分 子。 * 噬菌体：DNA分子除了复制起点之外，还有编 码外壳蛋白质的基因。
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4. 噬菌体的溶源生命周期


另一种类型的溶源周期是以噬菌体T1为原 型。比较少见。 基本特征是：不存在噬菌体DNA分子的整 合作用体系，而是变成了一种进行独立复 制的环形的质粒DNA分子。
4. 噬菌体的溶源生命周期
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Ⅲ、超感染免疫性： 溶源性细菌有两个重要特点： （1）超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次 感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性 这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染 免疫性。 （2）溶源性细菌的诱发：经过许多世代之后，溶 源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。
Ⅰ、若干基本概念

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噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
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插入型载体：只能承受较小分子量(一般在 10kb以内)的外源DNA片段的插入，广泛用 于cDNA及小片段DNA的克隆。
替换型载体：可承受较大分子量的外源 DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生 物的染色体。

（2）λ噬菌体载体的主要类型 Ⅰ、插入型载体： 插入失活效应：外源的DNA 克隆到插入型的λ噬 菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧 失效力。 免疫功能失活的插入型载体：在基因组的免疫区 中插入外源DNA片段，载体所具有的合成活性 阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。 只能形成清晰的噬菌斑。 * 有外源DNA插入：清晰的噬菌斑。 * 没有外源DNA插入：亲本噬菌体可以进入溶源 状态，形成浑浊的噬菌斑。 β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：（下页）
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β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：

(256Байду номын сангаас)




这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其 中有编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ。 这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在加有IPTG 和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。 如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖苷酶 基因lacZ的编码序列，那么由这种λ重组体感染的lac-指 示菌，由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬 菌斑。 如使用大肠杆菌Lac+指示菌，无论有无外源DNA插入， 都形成蓝色噬菌斑。 可以应用Xgal-IPTG显色技术检测转化子。


DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。(张)
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λ噬菌体：

作为基因克隆载体的一个重要特性： 由外源基因取代非必要基因所形成的重组 噬菌体DNA，可以随着寄主大肠杆菌细胞 一道复制和增殖，而且在其溶源周期中， 它们的DNA是整合在大肠杆菌的染色体 DNA上，成为后者的一个组成部分。
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3. 噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为： 溶菌周期。 溶源周期。 两种类型的噬菌体： 烈性噬菌体：只有溶菌周期。 温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。
(242页)
3. 噬菌体的溶菌生命周期 基本过程为：
（1）吸附：噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。 （2）注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。 （3）转变：被感染的细菌成为制造噬菌体颗粒的场所。 （4）合成：功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核 酸和蛋白质。 （5）组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。 （6）释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放 出来。
Xgal-IPTG显色反应（285页）


具有功能活性的β-半乳糖苷酶是四聚体。 Xgal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) ：无色化合物。 β-半乳糖苷酶能将无色的Xgal切割成半乳糖和深蓝色的 底物5-溴-4-氯靛蓝。因此，Xgal可作为检测β-半乳糖苷 酶的一种指示剂。 IPTG：一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的 条件下，它可以诱导细胞合成β-半乳糖苷酶。 称IPTG为β-半乳糖苷酶的安慰诱导物。 乳糖诱导物IPTG（372页）