流式细胞仪数据分析

流式细胞仪数据分析

5.1 数据采集及显示

光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。

根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计

收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。

数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。

处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。

习题：数据采集及显示

1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。

2 二维点图用于显示参数。

3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。

5.2 设门

通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其

数据结果只反映淋

巴细胞亚群的荧光特性。图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图

习题：设门

1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对错）

5.3 细胞亚群的数据分析

数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。

图5-3 选定淋巴细胞亚群设门

门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。

图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002）图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。

图5-5 直方图统计结果

二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于

设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。

图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。

图5-7 散点图统计结果另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。

图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。

图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比

5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析

这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。

图5-11 单细胞株分析图除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。

QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。

图5-13 细胞周期的DNA直方图

习题：数据分析

1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？