高效液相色谱结果分析第二讲

检测器
记录仪
积分仪
色谱工作站
色谱仪信号输出图
数据处理原理
➢ 峰的检测 ➢ 数据采集 ➢ 基线校正和重叠峰的分离
数据处理方法
➢自动处理 ➢人工修正
二.色谱图 (Chromatogram)
色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图, 其纵坐标为信号强度, 横坐标为时间
样品组分分离示意图
基线
基线噪音
基 线 飘 移
三.液相色谱图名词术语(8)
标准偏差(σ)(Standard deviation): 0.607倍峰高
处峰宽的一半，为便于测量，改用半峰宽。目的是
为了计算柱效率(柱效)。
柱效（理论塔板数）
：N
＝
tR
2
或
2
N＝5.54
tR W1/
2
标准偏差σ
进样
半峰宽
峰宽
塔板理论 类似蒸馏中的气液平衡
回收率
M - 空白
R=
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如 高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
4.精密度(precision)
三.液相色谱图名词术语(6)
拖尾峰(Tailing Peak): 后沿较前沿平缓的不对称峰. 前伸峰(Leading Peak): 前沿较后沿平缓的不对称峰. 鬼峰(Ghost Peak): 并非由试样所产生的峰,亦称假峰.
Excellent t = 1.0 - 1.05
Acceptable t = 1.2
三.色谱图名词术语(1)
色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响 应信号.
峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线. 峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离.
响应值 (mV)
←色谱峰
峰底 时间(分)
基线 ↓
峰高
三.色谱图名词术语(2)
切线峰宽(Peak Width, 峰宽):在峰两侧拐点处所作切线 与峰底相交两点之间的距离.
死时间(t0)(Dead time): 不被固定相滞留组分的出峰时 间.（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸 收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色 谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）.
调整保留时间：tR’＝ tR－t0
三.液相色谱图名词术语(4)
保留体积(VR)(Retention volume): 组分从进样到出 现峰最大值所需的流动相体积.
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!
3.准确度(accuracy)
准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近 的程度，用百分回收率表示。
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度,应 控制在100%左右(95%～105%)。
绝对回收率 模拟生物样品经整个样品处理过程,而相应 标准溶液直接分析,两者的响应值之比称为绝对回收率。 绝对回收率一般应大于70%,过低说明方法中待测物质 损失严重。
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收 试验法”和“加样回收试验法”。
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
死体积(V0)(Dead volume): 不被固定相滞留的组分, 从进样到出现峰最大值所需的流动相体积.
调整保留体积：VR’＝VR－V0＝tR’ • FC
Fc: 流动相的流速 mL/min.
三.液相色谱图名词术语(5)
谱带扩展(Band Broadening): 由于纵向扩散,传质阻 力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象.
图示中塔板数为3.
四.色谱峰检测
峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个 “阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。一般采 用下面两种方式判别峰讯号的变化：
➢依 照 信 号 斜 率 的 变 化检测信号
➢依 照 积 分 面 积 检 测 峰信号
切线 色谱峰的判断 最小面积
五.HPLC 测定步骤与内容
半峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点 作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的 距离 .
峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值.
切线 半峰宽 切线峰宽
响应值
峰面积
色谱峰的判断 (最小面积)
时间
三.液相色谱图名词术语(3)
保留时间(TR)(Retention time): 组分从进样到出峰最大 值所需的时间.
1.确定色谱条件: 色谱柱的选择，流动相、流速、 检测波长、柱温及进样量Ｓ等。
2.绘制标准工作曲线 Байду номын сангаас.精密度试验与回收率试验 4.实际样品含量测定
1.确定色谱条件
色谱柱的选择 流动相 流速 检测波长 柱温 进样量
2.绘制标准工作曲线
标准曲线是定量分析的根本依据. 药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号
结果处理与分析 第二部分
高效液相色谱
(High performance Liquid Chromatography，HPLC)
一、色谱数据处理 二、色谱图 三、色谱图名词术语 四、色谱峰检测 五、HPLC测定步骤与内容
一.色谱数据处理
色谱数据处理是通过ADC转换器,把模拟信号转换成数 字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。
精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取
样测定所得结果之间的接近程度,表示测定的重现性。用
偏差（d）、标准偏差(SD )、相对标准偏差(RSD )(变异
系数，CV )表示.
(1)偏差(d）：
测量值与平均值之差
d=xi -x
(2)标准(偏)差(SD或S） S =
xi - x2
n -1
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线波 动.
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变化.