第四章 细胞生物学的研究技术
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的差异，在同一离心场内的沉降速度不同。 • 过程：匀浆，离心分离，分析
装甲室
沉降物
转子
冷冻
马达
真空
肝脏
完整 细胞
静置20min
上清夜 完整 细胞
1000g 20min
10000g 20min
100000g 120min
DNase
105000g 20min
匀浆物 核
微粒体
线粒体 溶酶体 过氧化物酶体
• 分离DNA的目的： 认识与细胞某一特定生命 活动相关基因的结构和功能。前提是要知道所 分离基因的核苷酸序列（部分或全部的）。
第四节 活细胞内分子的分析
• 目的：认识一些特殊分子在细胞内存在的量和 位置，以及他们在细胞生命活动中的动态变化 等方面情况。
一、细胞内分子的示踪
• 将放射性核素标记的，可参与某种大分子物质 合成的前体物质加入到细胞培养液中，经过一 定时间的培养，使标记的前体物质进入细胞内， 带有放射性的前体物质便可进入大分子中。
内质网
核糖体
二、蛋白质的层析分离
• 蛋白质是细胞中重要的组分，种类繁多，生化性 质和功能活动复杂。
• 原理：利用分子的大小、极性及亲水性等生化特 性将不同类型蛋白质进行分离。
• 分离方法：柱层析（离子交换，疏水分子筛，亲 和性）；高压液相层析。
凝胶过滤柱层析
离子交换柱层析
亲合层析
三、蛋白质的电泳分析
• 方法：免疫组织化学，免疫细胞化学
第五节 细胞的活体内研究
一、细胞的活体内移植 将细胞标记上荧光或其他示踪物，再将它们移植 到适当的动物体内，然后连续地在不同的时间点 取材，并以一定的方法分析所植入细胞在活体中 的行为。
二、活体动物细胞的遗传修饰
转基因小鼠（transgenic mouse） 基因剔除小鼠（gene knockout mouse） 基因替换小鼠（gene knockin mouse）
胞骨架的立体网络。
电镜样品的制样技术
• 超薄切片技术 • 负染色技术 （染背景不染样品） • 冰冻蚀刻复型技术 • 扫描电镜样品制备技术
冰冻蚀刻复型技术
• 标本置于-196˚C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本 断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露 出断面结构，称为蚀刻（etching）。
断裂
蚀刻
• 视野的背景是黑的， 物体的边缘是亮的。
• 能见到小至 4nm的微粒子，分辨率可比普通显微 镜高50倍。
普通显微镜
相差显微镜
DIC显微镜
暗视野显微镜
荧光显微镜 (Fluorescence Microscope)
• 照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品； • 光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；
• 用电子束作光源，用 电磁场作透镜，分辨 力可达0.2nm。
• 主要用于观察细胞内 部结构。
• 由于电子束的穿透力 很弱，用于电镜的标 本须制成厚度约4050nm的超薄切片。
扫描电镜
(scanning electron microscope，SEM ) • 电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子
• 分析的目的：了解某一特定细胞或组织中某个或 某些基因的 mRNA 水平。或者比较两种或多种 类型或状态细胞中基因活动的差异。
• 分析的方法：PCR，Northern 杂交，mRNA的 消减杂交及基因芯片等。
五、DNA 的分离与分析
• 基因组DNA分离的方法：使用RNA酶消化掉 细胞内存在的各种RNA，利用DNA溶于水， 可以被乙醇沉淀的特性将其分离。
sorting, FACS)
二、细胞的体外培养
• 一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖， 而且可以表现出它在体内的一些分化特性。
1. 细胞体外生长条件： 培养基：必须氨基酸、维生素、动物血清、 糖、盐 支持物：塑料、玻璃，或包被包外基质 其它条件：pH值、CO2、温度、湿度，无菌环境等
一些有关细胞培养的概念
原代培养：由起始实验材料所进行的细胞培养 传代培养：对已有的细胞进行的继续培养 细胞系：通过原代培养所长出的细胞培养物 有限性细胞系：不能传代或只能传少数几代 连续性细胞系：能够连续地传很多代 永久性细胞系：能够无限地传代 细胞株：由单一类型的细胞所组成的细胞系。
2. 体外培养细胞的特性
形态特征：上皮形、梭形、多角形、圆形…
被收集、转换、放大后显示在荧光屏上。
• 图像为立体形象， 反映了标本的表面 结构。
• 分辨力约为3nm。
高压电镜
(high voltage electron microscope)
• 加速电压大于120kV的透射电镜。 • 穿透力强，观察标本的厚度可达10um，已达一
个完整细胞厚度。 • 可以得到细胞内部的三维精细结构图象，如细
• 蚀刻后，向断面以45度角 喷涂一层蒸汽铂，再以90 度角喷涂一层碳，加强反 差和强度。然后用次氯酸 钠溶液消化样品，把碳和 铂的膜剥下来，此膜即为 复膜（replica）。
• 复膜显示出了标本蚀刻面 的形态，在电镜下得到的 影像即代表标本中细胞断 裂面处的结构。
复膜
扫描隧道显微镜
(scanning tunneling microscope，STM )
• 根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 • 分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达
0.001nm。固态、液态和气态物质均可进行观察。 • 利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如
DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些 生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。
原子力显微镜
• 相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所 观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物 大分子的观察。还可以在空气或各种溶剂体系中 直接观察，故其适用范围有明显扩大。
（一）普通光学显微镜 （二）相差显微镜 （三）微分干涉差显微镜 （四）暗视野显微镜 （五）激光扫描共聚焦显微镜 （六）荧光显微镜
普通光学显微镜
目镜
物镜 载物台
集光器 光源
最大分辨率 0.2μm；最大放大倍数 1000倍。
H-E染色后的上皮柱状细胞
相差显微镜
(phase contrast microscope)
增殖特性：一般细胞能传十代左右， 少数细胞可传40-50代 极少数细胞变成永久细胞 人为分为 I II III 三个时期 （增殖期、平殖期、衰退期）
功能特性：可以保留活体组织中的某些功能特性， 随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。
三、细胞融合
• 细胞融合（cell fusion）：两个或两个以上的细 胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象。
第四章 细胞生物学的研究技术
Techniques in Cell Biology
Refer to knowledge
Preparatory observe put forward theoretics Design control tests
Collect data Explain results
• 追踪放射性标记即可探知相关生物大分子的情 况。
常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNA的放射自显影图像
二、细胞内离子浓度的测定
• 探测细胞内离子分子及其浓度的瞬时改变。需要 有精密的设备和专门的技术。
• 局部离子浓度测定：膜片钳技术。
• 瞬间快速变化的离子浓度测定：利用离子敏感性 指标剂去感受某种离子的存在，并以发光的强弱 来反映所测定离子浓度的高低。如，发光蛋白指 标剂，荧光钙指标剂。
三、特殊分子向细胞的导入
• 可阻断特定内源性分子功能活动的分子：如抗体 或其他抑制物等。
• 带有标记的可参与细胞结构与功能活动的分子： 如荧光标记的微管蛋白 方法： 显微注射 直接扩散 膜泡介导法
四、细胞内特异分子的原位鉴定
• 主要是细胞内的蛋白质分子
• 原理：利用抗体对抗原的特异性识别与结合的特 性，实现对目标蛋白质在细胞内存在、分布，以 及其与细胞功能活动相关性的认识。
• 电泳分析可以得到蛋白质分子大小，以及是否由 多个亚基单位组成等的信息。
• 原理：在一个电场中，蛋白质的迁移率与其大小、 形状和电荷的强弱等因素有关。
• 方法：SDS-PAGE, western blotting, 二维凝胶 电泳（2-D）。
四、RNA的分离与分析
• 分离方法：在抑制RNA酶前提下，利用RNA分 子通常很小且可溶于水，并能在乙醇中沉淀等生 化特征将其分离。
• 有两个特殊的滤光 片，光源前的用以 滤除可见光，目镜Baidu Nhomakorabea和物镜之间的用于 滤除紫外等，用以 保护人目。
荧光染料
抗体
特异性结合
抗原 (细胞的蛋白质成分)
分裂细胞的 免疫荧光图像
激光扫描共聚焦显微镜
(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)
• 用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描， 得到光学切片，并可整合为三维影像。
二、亚微结构的观察
• 亚微结构（submicroscpic structure）---- 细胞 中直径小于0.2um的结构。
• 超微结构（ultramicroscopic structure）---- 接 近分子水平的结构。
（一）电子显微镜 （二）扫描探针显微镜
透射电镜
(transmission electron microscope，TEM )
• 人工诱导的方法：生物诱导法、化学诱导法、物 理诱导法。
• 异核体（heterokaryon）：两个不同的细胞融合 到一起，但其核仍然是分开的。
• 合核体（synkaryon） • 杂种细胞系（hybrid cell line）
第三节 细胞组分的分析
一、细胞器和大分子的离心分离
• 适合于各种细胞器和大分子的分离。 • 原理：利用各种细胞器或组分的大小和相对密度
倒置相差显微镜
相板
环状光阑
• 荷兰物理学家 F. Zernike 于1932年发明：利用光的 衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光程差转变 成振幅差，从而提高了活细胞结构的反差，解决了对 活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（1953）。
微分干涉差差显微镜
(differential interference contrast (DIC) microscope)
• 不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的 可重复性大大提高。
第二节 细胞的分离与培养
• 有效获得单一类型的细胞 • 获得较大的细胞群体 • 细胞工程方面的应用
一、细胞的分离
• 利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理。
• 从细胞悬液中分离某种细胞： 流式细胞仪
（flow cytometer, FCM） 亦称荧光激活细胞分选器 (fluorescence-activated cell
Devise conclusion
第一节 细胞形态结构的观察
形态观察
光学显微镜 电子显微镜
普通光镜 特殊光镜
暗视野显微镜 相差显微镜 微分干涉差显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜
透射电镜 扫描电镜 高压电镜
扫描探针显微镜
扫描隧道显微镜 原子力显微镜
一、显微结构的观察
• 显微结构（microscopic structure）----通过光学 显微镜观察到的细胞结构。
• Nomarski于1952年在相差显微镜原理的基础上 发明，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。 与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率 差别更大，故影像的立体感更强。
DIC显微镜下的 硅藻（伪彩色）
暗视野显微镜
(dark field microscope)
• 聚光镜中央有挡光 片，照明光线不直 接进人物镜，只允 许被标本反射和衍 射的光线进入物镜。
装甲室
沉降物
转子
冷冻
马达
真空
肝脏
完整 细胞
静置20min
上清夜 完整 细胞
1000g 20min
10000g 20min
100000g 120min
DNase
105000g 20min
匀浆物 核
微粒体
线粒体 溶酶体 过氧化物酶体
• 分离DNA的目的： 认识与细胞某一特定生命 活动相关基因的结构和功能。前提是要知道所 分离基因的核苷酸序列（部分或全部的）。
第四节 活细胞内分子的分析
• 目的：认识一些特殊分子在细胞内存在的量和 位置，以及他们在细胞生命活动中的动态变化 等方面情况。
一、细胞内分子的示踪
• 将放射性核素标记的，可参与某种大分子物质 合成的前体物质加入到细胞培养液中，经过一 定时间的培养，使标记的前体物质进入细胞内， 带有放射性的前体物质便可进入大分子中。
内质网
核糖体
二、蛋白质的层析分离
• 蛋白质是细胞中重要的组分，种类繁多，生化性 质和功能活动复杂。
• 原理：利用分子的大小、极性及亲水性等生化特 性将不同类型蛋白质进行分离。
• 分离方法：柱层析（离子交换，疏水分子筛，亲 和性）；高压液相层析。
凝胶过滤柱层析
离子交换柱层析
亲合层析
三、蛋白质的电泳分析
• 方法：免疫组织化学，免疫细胞化学
第五节 细胞的活体内研究
一、细胞的活体内移植 将细胞标记上荧光或其他示踪物，再将它们移植 到适当的动物体内，然后连续地在不同的时间点 取材，并以一定的方法分析所植入细胞在活体中 的行为。
二、活体动物细胞的遗传修饰
转基因小鼠（transgenic mouse） 基因剔除小鼠（gene knockout mouse） 基因替换小鼠（gene knockin mouse）
胞骨架的立体网络。
电镜样品的制样技术
• 超薄切片技术 • 负染色技术 （染背景不染样品） • 冰冻蚀刻复型技术 • 扫描电镜样品制备技术
冰冻蚀刻复型技术
• 标本置于-196˚C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本 断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露 出断面结构，称为蚀刻（etching）。
断裂
蚀刻
• 视野的背景是黑的， 物体的边缘是亮的。
• 能见到小至 4nm的微粒子，分辨率可比普通显微 镜高50倍。
普通显微镜
相差显微镜
DIC显微镜
暗视野显微镜
荧光显微镜 (Fluorescence Microscope)
• 照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品； • 光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；
• 用电子束作光源，用 电磁场作透镜，分辨 力可达0.2nm。
• 主要用于观察细胞内 部结构。
• 由于电子束的穿透力 很弱，用于电镜的标 本须制成厚度约4050nm的超薄切片。
扫描电镜
(scanning electron microscope，SEM ) • 电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子
• 分析的目的：了解某一特定细胞或组织中某个或 某些基因的 mRNA 水平。或者比较两种或多种 类型或状态细胞中基因活动的差异。
• 分析的方法：PCR，Northern 杂交，mRNA的 消减杂交及基因芯片等。
五、DNA 的分离与分析
• 基因组DNA分离的方法：使用RNA酶消化掉 细胞内存在的各种RNA，利用DNA溶于水， 可以被乙醇沉淀的特性将其分离。
sorting, FACS)
二、细胞的体外培养
• 一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖， 而且可以表现出它在体内的一些分化特性。
1. 细胞体外生长条件： 培养基：必须氨基酸、维生素、动物血清、 糖、盐 支持物：塑料、玻璃，或包被包外基质 其它条件：pH值、CO2、温度、湿度，无菌环境等
一些有关细胞培养的概念
原代培养：由起始实验材料所进行的细胞培养 传代培养：对已有的细胞进行的继续培养 细胞系：通过原代培养所长出的细胞培养物 有限性细胞系：不能传代或只能传少数几代 连续性细胞系：能够连续地传很多代 永久性细胞系：能够无限地传代 细胞株：由单一类型的细胞所组成的细胞系。
2. 体外培养细胞的特性
形态特征：上皮形、梭形、多角形、圆形…
被收集、转换、放大后显示在荧光屏上。
• 图像为立体形象， 反映了标本的表面 结构。
• 分辨力约为3nm。
高压电镜
(high voltage electron microscope)
• 加速电压大于120kV的透射电镜。 • 穿透力强，观察标本的厚度可达10um，已达一
个完整细胞厚度。 • 可以得到细胞内部的三维精细结构图象，如细
• 蚀刻后，向断面以45度角 喷涂一层蒸汽铂，再以90 度角喷涂一层碳，加强反 差和强度。然后用次氯酸 钠溶液消化样品，把碳和 铂的膜剥下来，此膜即为 复膜（replica）。
• 复膜显示出了标本蚀刻面 的形态，在电镜下得到的 影像即代表标本中细胞断 裂面处的结构。
复膜
扫描隧道显微镜
(scanning tunneling microscope，STM )
• 根据量子力学原理中的隧道效应而设计。 • 分辨率很高，横向为0.1~0.2nm，纵向可达
0.001nm。固态、液态和气态物质均可进行观察。 • 利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如
DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些 生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。
原子力显微镜
• 相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所 观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物 大分子的观察。还可以在空气或各种溶剂体系中 直接观察，故其适用范围有明显扩大。
（一）普通光学显微镜 （二）相差显微镜 （三）微分干涉差显微镜 （四）暗视野显微镜 （五）激光扫描共聚焦显微镜 （六）荧光显微镜
普通光学显微镜
目镜
物镜 载物台
集光器 光源
最大分辨率 0.2μm；最大放大倍数 1000倍。
H-E染色后的上皮柱状细胞
相差显微镜
(phase contrast microscope)
增殖特性：一般细胞能传十代左右， 少数细胞可传40-50代 极少数细胞变成永久细胞 人为分为 I II III 三个时期 （增殖期、平殖期、衰退期）
功能特性：可以保留活体组织中的某些功能特性， 随着传代代数增多，功能特性逐渐丧失的也越多。
三、细胞融合
• 细胞融合（cell fusion）：两个或两个以上的细 胞相互接触并合并而形成一个细胞的现象。
第四章 细胞生物学的研究技术
Techniques in Cell Biology
Refer to knowledge
Preparatory observe put forward theoretics Design control tests
Collect data Explain results
• 追踪放射性标记即可探知相关生物大分子的情 况。
常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNA的放射自显影图像
二、细胞内离子浓度的测定
• 探测细胞内离子分子及其浓度的瞬时改变。需要 有精密的设备和专门的技术。
• 局部离子浓度测定：膜片钳技术。
• 瞬间快速变化的离子浓度测定：利用离子敏感性 指标剂去感受某种离子的存在，并以发光的强弱 来反映所测定离子浓度的高低。如，发光蛋白指 标剂，荧光钙指标剂。
三、特殊分子向细胞的导入
• 可阻断特定内源性分子功能活动的分子：如抗体 或其他抑制物等。
• 带有标记的可参与细胞结构与功能活动的分子： 如荧光标记的微管蛋白 方法： 显微注射 直接扩散 膜泡介导法
四、细胞内特异分子的原位鉴定
• 主要是细胞内的蛋白质分子
• 原理：利用抗体对抗原的特异性识别与结合的特 性，实现对目标蛋白质在细胞内存在、分布，以 及其与细胞功能活动相关性的认识。
• 电泳分析可以得到蛋白质分子大小，以及是否由 多个亚基单位组成等的信息。
• 原理：在一个电场中，蛋白质的迁移率与其大小、 形状和电荷的强弱等因素有关。
• 方法：SDS-PAGE, western blotting, 二维凝胶 电泳（2-D）。
四、RNA的分离与分析
• 分离方法：在抑制RNA酶前提下，利用RNA分 子通常很小且可溶于水，并能在乙醇中沉淀等生 化特征将其分离。
• 有两个特殊的滤光 片，光源前的用以 滤除可见光，目镜Baidu Nhomakorabea和物镜之间的用于 滤除紫外等，用以 保护人目。
荧光染料
抗体
特异性结合
抗原 (细胞的蛋白质成分)
分裂细胞的 免疫荧光图像
激光扫描共聚焦显微镜
(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)
• 用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描， 得到光学切片，并可整合为三维影像。
二、亚微结构的观察
• 亚微结构（submicroscpic structure）---- 细胞 中直径小于0.2um的结构。
• 超微结构（ultramicroscopic structure）---- 接 近分子水平的结构。
（一）电子显微镜 （二）扫描探针显微镜
透射电镜
(transmission electron microscope，TEM )
• 人工诱导的方法：生物诱导法、化学诱导法、物 理诱导法。
• 异核体（heterokaryon）：两个不同的细胞融合 到一起，但其核仍然是分开的。
• 合核体（synkaryon） • 杂种细胞系（hybrid cell line）
第三节 细胞组分的分析
一、细胞器和大分子的离心分离
• 适合于各种细胞器和大分子的分离。 • 原理：利用各种细胞器或组分的大小和相对密度
倒置相差显微镜
相板
环状光阑
• 荷兰物理学家 F. Zernike 于1932年发明：利用光的 衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光程差转变 成振幅差，从而提高了活细胞结构的反差，解决了对 活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（1953）。
微分干涉差差显微镜
(differential interference contrast (DIC) microscope)
• 不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的 可重复性大大提高。
第二节 细胞的分离与培养
• 有效获得单一类型的细胞 • 获得较大的细胞群体 • 细胞工程方面的应用
一、细胞的分离
• 利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理。
• 从细胞悬液中分离某种细胞： 流式细胞仪
（flow cytometer, FCM） 亦称荧光激活细胞分选器 (fluorescence-activated cell
Devise conclusion
第一节 细胞形态结构的观察
形态观察
光学显微镜 电子显微镜
普通光镜 特殊光镜
暗视野显微镜 相差显微镜 微分干涉差显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦显微镜
透射电镜 扫描电镜 高压电镜
扫描探针显微镜
扫描隧道显微镜 原子力显微镜
一、显微结构的观察
• 显微结构（microscopic structure）----通过光学 显微镜观察到的细胞结构。
• Nomarski于1952年在相差显微镜原理的基础上 发明，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。 与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率 差别更大，故影像的立体感更强。
DIC显微镜下的 硅藻（伪彩色）
暗视野显微镜
(dark field microscope)
• 聚光镜中央有挡光 片，照明光线不直 接进人物镜，只允 许被标本反射和衍 射的光线进入物镜。