开菲尔粒中一株高加索酸奶乳杆菌的分离及鉴定

开菲尔粒中一株高加索酸奶乳杆菌的分离及鉴定

Identification of a Strain of Lactobacillus Kefiri Isolated from Kefir Grains

摘要目的：确从黑龙江民间流传使用的开菲尔粒中分离到一株优势乳酸菌，并命名为 HUCM 101，经形态学及 16SrR NA 序列分析，鉴定为高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri），其 16S rR NA 基因序列在国际 Genbank 数据库中的序列注册号为 KC845576。

关键词：开菲尔；高加索酸奶乳杆菌；分离；鉴定

Abstract:Objective: One predominant lactic acid bacteria named HUCM 101 was isolated from the kefir which was used popularly

among folk families of Heilongjiang, China. This bacteria was identified to be Lactobacillus kefiri by phenotypical characteristics and 16S

rRNA sequences. The Genbank accession number of 16S rRNA sequences of HUCM 101 strain is KC845576.

Keywords: Lactobacillus kefiri; isolation; identification

开菲尔是原产自高加索地区的一种传统酒精性发酵乳

饮料，至今已有数千年的饮用历史。开菲尔是其英文名称

Kefir 的音译，Kefir 源自土耳其语“Kef”，寓有安康、安宁、幸

福之意，并有爽快的味道的意思

[1]

。由于开菲尔具有多种特殊

的保健功效，如抗肿瘤

[2]

、抗突变

[3]

、抗氧化

[3,4]

、抗过敏

[5]

、降血

压

[6]

、降胆固醇

[7]

、调节机体免疫力

[8]

等，且风味和口感独特，因

而深受许多国家和地区消费者的喜爱，在我国的东北、内蒙

古、新疆和西藏等地区的民间家庭也有饮用 Kefir 的历史，但

至今国内仍未有商业化产品上市。

传统的 Kefir 是以牛乳或羊乳为主要原料，由开菲尔粒

（Kefir Grains，简称 KG）作为发酵剂发酵而成。KG 是一种外

形不规则，表面卷曲，富有弹性，多为白色或米黄色（被杂菌

3. 讨论

根据前列地尔的产品特点，我们在对赋形剂进行选择时

主要采用常用的冻干赋形剂甘露醇、葡萄糖和右旋糖酐进行

筛选，选择确定右旋糖酐为赋形剂。活性炭对本品的吸附不

大，根据常规用量，选择 0.1%作为本品的活性炭吸附用量。

测定本品的冻干共熔点后，我们参考有关文献制订了几个冻

干条件，主要根据冻干产品的外形，溶解性和含水量对冻干

条件进行选择。其中两个冻干条件制备的产品差异不大，但

综合考虑后，从经济角度考虑决定本品的冻干条件，筛选掉

其中冻干时间较长的一个，确定用 18 小时的冻干过程。

参考文献

[1] 李勇，唐捷.前列地尔的药理研究进展[J].西南军医，2006，8（6）:

79- 81.

[2] 杨华勇，张新军.前列地尔临床应用进展[J].华西医学，2005，20

（4）:147- 149

[3] 《中国药典》2005 年版[S（]二部）.北京:化学工业出版社，2005:

448~449.

收稿日期：2013- 07- 29

·810·黑龙江医药 Heilongjiang Medicine Journal Vol.26 No.5 2013污染后会呈黄色），直径 3~20mm不等，呈花椰菜或珊瑚状的

粒状物。KG是由多种微生物经过长期作用后形成的微生物

共生体，其菌相极其复杂，且因来源、培养条件不同而异，主

要包括乳酸菌、酵母菌以及少量的醋酸菌等，此外也有报道

称发现过双歧杆菌

[9,10]

。KG的骨架主要是由乳酸菌自身代谢

产生的胞外黏性多糖（约占 50%），结合大量水和少量蛋白

质、脂肪以及其他成分共同构成，其中胞外多糖为微生物固

定化的主要支撑体。其在发酵过程中既有乳酸菌参与的乳酸

发酵，又有酵母菌参与的酒精发酵，故形成的 Kefir 是一种集

酸味、醇味于一体，同时伴有少量 CO

2

产生的酒精性发酵乳

制品，故有“发酵乳制品中之香槟”的美誉

[1]

。作为发酵剂的

KG，其微生物的构成与分布直接决定了 Kefir 的风味与品

质。因此，研究 KG 中微生物的组成以及获得其中的优势菌

株至关重要。本文从家庭用的开菲尔粒中分离到一株优势乳

酸菌，并鉴定为高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 开菲尔粒的来源

开菲尔粒来自黑龙江哈尔滨市的普通家庭，用来制作开

菲尔的发酵剂。

1.1.2 培养基与试剂

10%脱脂乳：10g 脱脂乳粉溶解于 100mL 蒸馏水中，

115℃、10min 湿热灭菌。

改良 MRS 培养基（g/L）：蛋白胨 5g，胰蛋白胨 10g，酵母

粉 5g，牛肉膏 5g，葡萄糖 20g，吐温 - 80 1g，乙酸钠 5g，MgSO

4

·7H

2

O 0.58g，MnSO

4

·4H

2

O 0.25g，柠檬酸氢二铵 2g，

K

2

HPO

4

2g。HCl 调至 pH6.2，121℃、15min 湿热灭菌。

细菌基因组提取试剂盒购于天根生化科技有限公司；

Taq DNA 聚合酶购于宝生物工程（大连）有限公司；DNA 序

列测定由华大基因（深圳）完成；其余试剂均为分析纯。

1.1.3 主要仪器设备：

显微镜（LEICA），Delta320 pH 计（梅特勒 - 托利多），分

析天平（梅特勒 - 托利多），全自动高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台。

1.2 试验方法

1.2.1 开菲尔粒的活化

开菲尔粒用无菌的生理盐水充分冲洗后，将其接种于

10%脱脂乳培养基中，25℃恒温培养，直至活力恢复。

1.2.2 乳酸菌的分离与纯化

将活化好的开菲尔粒在无菌条件下捣碎，并重悬于无菌

生理盐水中，取菌悬液做适当浓度梯度稀释，取梯度稀释液

涂布于含 0.75% CaCO3 的改良 MRS 琼脂平板上

[11]

，37℃恒

温培养 48h 后，挑取菌落周围形成透明圈的菌落，将 G+ 菌

株继续用 MRS琼脂平板划线，直至确定为纯菌，并记录菌落