人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)说明书
心肌同工酶(CK-MB)测定操作规程(SOP)
心肌同工酶(CK-MB)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清样品中肌酸激酶同工酶（CKMB）的活性。
二、临床意义（一）概述肌酸激酶是由M型和B型两种亚基组成的二聚体，结合形成三种CK同工酶：CK-BB、CK-MB、CK-MM。
骨骼肌中大多数为CK-MM；胃肠道和脑组织中以CK-BB为主；心肌中以CK-MB为主。
当心肌损害，特别是发生心肌梗塞时，血液中CK-MB水平升高。
胸疼发生后4-6小时CK-MB水平开始升高，12-24小时到达高峰，48小时后回到基质水平。
（二）临床意义CK－MB主要存在于心肌中，约为心肌总CK的１4％,血清CK-MB上升先于总活力的升高，24小时达峰值，36小时内其波动曲线与总活力相平行，至48小时消失。
（三）医学决定水平15U/L: 高于此值，且有持续性临床表现（胸痛、心电图显示特异性改变等），提示为急性心肌梗塞，应及时进行治疗。
90U/L: 高于此值多由于非心肌性CK-MB释放，如恶性肿瘤，应采取其他有关诊断方法，予以确诊。
三、检验原理磷酸肌酸 + ADP −−→−-B CK肌酸 + ATP ATP + 葡萄糖−−→−HK葡萄糖-6-磷酸 + ADP葡萄糖-6-磷酸 + NADP −−−−→−PDH G 66-磷酸-葡萄糖 + NADPH + H+用特异的抗CK-M 抗体抑制CK-M 的活性，在340nm 波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A ／min)，测定CK-B 的活性，将CK-B 活性测定值乘以2，即可计算出样品中CK-MB 的活性。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
肌酸磷酸激酶同功酶(CK-MB) DGKC速率法
目录1. 检测原理2. 标本采集与处理2.1 受检者的准备2.2 静脉采血2.3 抗凝剂2.4 标本处理3. 试剂3.1 试剂3.2 校准血清3.3 试剂、校准血清的稳定性4. 仪器5. 操作6. 计算7. 操作性能7.1 精密度7.2 准确度7.3 灵敏度7.4 可报告范围7.5 特异性7.6 干扰8. 参考值9. 临床意义附录A: 参数1. 检测原理试剂中加入抑制CK-M的抗体，它能完全抑制CK-M亚基的活性而不影响CK-B亚基的活性，所得结果乘以2即得CK-MB的活性。
CK肌酸磷酸+ ADP ----------- 肌酸+ ATPHKATP + 葡萄糖--------- 葡萄糖-6-磷酸+ ADPG6PDH葡萄糖-6-磷酸+ NADP+------------ 6-磷酸葡萄糖酸+ H+ + NADPH2．本采集与处理2.1 受检者的准备：病人空腹12h，不饮酒24h后采集血样。
体检对象抽血前应有两周的的正常状况。
孕妇应在产后或终止哺乳3个月后检验。
此外，有无服用影响的药物以及采血的季节都应做相关记录。
2.2 静脉采血：除非是卧床的病人，一般在采血时取坐位。
体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。
在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。
2.3 抗凝剂：血浆使用肝素或EDTANa2（1mg/mL）作为抗凝剂。
2.4 标本处理：血标本室温放置30min～45min后离心分离血清或血浆，在两小时内检测完毕；如两小时内不能检测完毕，将离心分离血清或血浆置洁净试管加盖2-8℃保存。
3．试剂3.1 试剂：本科使用湖南永和阳光科技有限责任公司CK-MB试剂盒，为液体双试剂，各组分如下：3.2：校准血清使用湖南永和阳光科技有限责任公司提供的CKMB校准血清。
校准频次：空白定标：每日需做试剂空白定标。
全点定标：试剂换批号使用时或质控结果超过规定的2SD范围，需要全点定标。
肌酸激酶同工酶定量测定试剂盒标准操作程序
肌酸激酶同工酶测定标准操作程序1. 摘要肌酸激酶MB 型同工酶（CK-MB ）试剂盒（免疫抑制法）试剂盒适用于在生化分析仪上定量测定人血清肌酸激酶MB 型同工酶（CK －MB ）的活力。
2. 适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中CK-MB 的浓度。
3. 职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定CK-MB 浓度的工作人员要严格按照本SOP 程序进行,室负责人监督管理；本SOP 的改动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4. 检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的肌酸激酶MB 型同工酶（CK-MB ）试剂盒采用的是免疫抑制法。
5. 原理应用抗CK-M 抗体抑制CK-M ，但不影响MB 和BB 中B 单位活性，然后用CK 试剂（NAC 为激活剂）测试CK 的活力，测得的CK 活力乘以2即为CK-MB 活力，即肌酸激酶（CK ）催化磷酸肌酸与二磷酸腺苷（ADP ）反应产生三磷酸腺苷（ATP ）与肌酸；偶联己糖激酶（HK ）及葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD ）的催化反应。
HK 催化葡萄糖与ATP 反应，形成葡萄糖－6－磷酸（G6P ），G6PD 催化G6P 氧化，形成6－磷酸葡萄糖内酯（6－PG ）及还原型辅酶Ⅱ（NADPH ）。
NADPH 形成的速率与血清中肌酸激酶（CK ）的活性成正比。
+-+++−−−→−+++−→−++−−−→−+H NADPH O H NADP ADPATP ATPADP DH P G HK PH CK 磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖葡萄糖肌酸磷酸肌酸-6--6--6-628.6,6. 仪器日立7600自动生化分析仪7. 试剂7.1 试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2 试剂瓶内主要成分：R1：咪唑缓冲液，醋酸镁，葡萄糖，EDTA ，AMP,ADP,NAD,5-磷酸二腺苷，N-乙酰半胱氨酸，己糖激酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，抗CK-M 抗体，防腐剂R2: 咪唑缓冲液，磷酸肌酶，防腐剂7.3试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。
CK-MB试剂盒说明书(罗氏)
11821598 322 100测试主要用途用免疫学方法定量测定人血清或血浆中肌酸激酶同工酶MB含量。
电化学发光免疫测定试剂，适用于罗氏Elecsys和cobas e免疫测定分析仪。
临床应用1、2、3肌酸激酶（CK）是一种二聚体酶，它有四种不同的形式：线粒体同工酶和胞浆同工酶CK-MM （肌型）、CK-BB（脑型）和CK-MB。
血清中CK-MB的测定值是诊断心肌缺血（例如急性心肌梗塞、心肌炎等）的重要指标。
CK-MB 在心脏症状出现3－8小时后即可检出并且可持续较长时间，这取决于病情经过。
CK-MB还可出现在其它临床条件下，例如横纹肌溶解症和中风。
实验室诊断方面，测定总体CK、肌钙蛋白T和/或肌红蛋百有助于鉴别这些临床疾病。
CK-MB测定的灵敏度与取样时间有关。
因此跟踪测定非常有意义。
Elecsys Ck-MB测定法采用了两种不同的直接对抗人CK-MB的单克隆抗体。
检测原理双抗体夹心法，总检测时间：18分钟●第一次孵育：15μl标本、生物素化的抗CK-MB单克隆抗体和钌（Ru）a标记的CK-MB特异性单克隆抗体一起反应生成抗原抗体夹心复合物。
●第二次孵育：添加包被链霉亲和素的磁珠微粒后，该复合物通过生物素和链霉素之间的反应结合到微粒上。
●将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。
未与磁珠结合的物质通过ProCell被去除。
给电极加以一定的电压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度。
●仪器自动通过2点校正的定标曲线计算得到检测结果。
a)Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium(II)-complex (Ru(bpy){23}三联吡啶钌试剂－工作溶液M 包被链霉亲和素的磁珠微粒（透明瓶盖），1瓶，6.5ml；包被链霉亲和素的磁珠微粒，0.72mg/ml；防腐剂。
R1 生物素化的抗CK-MB抗体（灰盖），1瓶，10mL：生物素化抗CK-MB单克隆抗体（小鼠）1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH值7.0；防腐剂。
CKMB
肌酸激酶同工酶MB（CKMB）的检测一、项目名称、检验方法名称1. 项目名称：肌酸激酶同工酶MB（CKMB）的检测2. 检验方法名称：化学发光法二、方法学原理：肌酸激酶同工酶MB测定采用双位点夹心化学发光免疫分析法，其采用的技术原理如下：第一步：将样本与包被着CK-MB单克隆抗体的超顺磁性磁微粒（磁珠）以及CK-MB单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物添加到反应管中，经过孵育，样本中的CK-MB和包被在磁珠上的CK-MB单克隆抗体结合，同时CK-MB单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物与样本中CK-MB另一位点结合。
反应完成后，磁场吸住磁珠，洗去未结合的物质。
第二步：将化学发光底物（3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD）添加到反应管内，发光底物AMPPD能有效地被碱性磷酸酶所分解, 脱去一个磷酸根基团，生成不稳定的中间产物，该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲酯阴离子，处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子从激发态返回基态时，产生化学发光，由光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量，所产生的光子数与样本内CK-MB的浓度成正比。
样本内分析物的量由定标曲线来确定。
三、试剂品牌、代号、包装规格、内含物1、试剂品牌：深圳迈瑞2、包装规格：2*503、内含物：Ra试剂：包被着抗CK-MB抗体的超顺磁性微粒，0.2 g/L；Tris缓冲液，50 mmol/L；ProClin 300，0.5 g/L；叠氮钠，0.9 g/L；Rb试剂：抗CK-MB抗体-碱性磷酸酶标记物，3 mg/L；MES缓冲液，50 mmol/L；ProClin 300，0.5 g/L；叠氮钠，0.9 g/L4、储存条件及有效期：2~8℃保存，有效期365天。
上机使用后，在2~8℃的贮存环境下有效期为28天四、仪器品牌、型号：迈瑞CL1000i五、具体操作步骤（包括主要的仪器测定参数）5.1校准：5.1.1校准品来源：试剂厂家的标准液。
血清肌酸激酶MB同工酶测定
血清肌酸激酶MB同工酶测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理使用CK-M 多克隆抗体对肌酸激酶（CK）中CK-M同工酶的活性进行抑制后，采用德国临床化学会（DGKC）和国际临床化学会（IFCC）推荐的连续监测法测定余下的肌酸激酶（CK）活性。
其反应原理如下：⑴CK-MM 型同工酶 + CK-M抗体→ CK-MM型同工酶的活性被抑制；CK-MB 型同工酶+ CK-M 抗体→ 50%的CK-MB 型同工酶的活性被抑制；⑵剩余的50%无活性的CK-MB型同工酶 + N-乙酰半胱氨酸→有活性的CK-B型同工酶CK同工酶⑶磷酸肌酸 + ADP 肌酸 + ATP己糖激酶(HK)ATP + 葡萄糖 ADP + 葡萄糖-6-磷酸(G6P-DH)葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+式中：ADP为二磷酸腺苷；ATP为三磷酸腺苷；NADP+为氧化型辅酶II；NADPH+H+为还原型辅酶II。
在上述反应中，NADPH+H+ 的生成速率与样本中肌酸激酶B 型同工酶（CK-B）的活性成正比。
通过在波长340nm 处监测吸光度值的上升速率，即可测得样本中肌酸激酶B 型同工酶（CK-B）的活性。
肌酸激酶B 型同工酶（CK-B）活性相当于1/2肌酸激酶MB型同工酶的活性，将所测得的肌酸激酶B型同工酶（CK-B）的活性乘以2，即为肌酸激酶MB 型同工酶（CK-MB）的活性。
3 标本：3.1 病人准备：无特殊。
3.2 类型：血清或肝素血浆。
3.3 标本存放：稳定性：-20℃保存稳定4周（避光保存）。
活性损失：2～8℃保存24小时或18～22℃保存1小时至少损失10%。
3.4 标本运输：常温条件下保存运输。
血标本应尽快送往化验室,室温下放置30―45分钟,后离心,放置时间不得超过3h.血清必须吸出,转移至有盖的试管中.3.5 标本拒收标准：细菌污染的标本。
4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司CK-MB试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1（R1）：D-葡萄糖27mmol/L 咪唑缓冲液60mmol/L乙酸镁14mmol/L NADP 2.7mmol/LN-乙酰半胱氨酸27mmol/L AMP 7mmol/L试剂2（R2）：磷酸肌酸 160mmol/L 6-磷酸葡萄糖脱氢酶≥20KU/LADP 11mmol/L 糖激酶≥20KU/LCK-M 抗体4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
肌酸激酶同工酶ck-mb偏高的原因
肌酸激酶同工酶CK-MB是一种存在于心肌细胞中的酶，它在心肌损伤时会释放到血液中。
检测血清中CK-MB水平的变化可以用来判断心肌损伤的程度和范围。
当CK-MB水平偏高时，可能表示患者存在心肌损伤或疾病。
在本文中，我们将探讨引起CK-MB偏高的可能原因，并探讨相关的治疗和预防措施。
一、心肌梗死心肌梗死是最常见的导致CK-MB水平升高的原因之一。
当冠状动脉发生阻塞，导致心肌血液供应不足，心肌细胞缺氧坏死时，CK-MB就会释放到血液中。
急性心肌梗死患者的CK-MB水平通常会显著升高。
二、心肌炎心肌炎是指由病毒、细菌、寄生虫或自身免疫等引起的心肌炎症。
在心肌炎患者中，由于心肌细胞受损，CK-MB水平也会升高。
在此情况下，及时的抗炎治疗非常重要，以防止心肌炎引起的心脏功能障碍。
三、心肌钙化心肌钙化是一种罕见的心脏疾病，患者的心肌细胞会出现异常的钙盐沉积，导致心肌功能减弱。
CK-MB水平的升高可以反映心肌细胞的受损程度。
四、心肌损伤除了心肌梗死和心肌炎外，其他原因导致的心肌损伤，如心脏手术、外伤等，也会导致CK-MB水平的升高。
在进行心脏手术或发生外伤后，定期检测CK-MB水平可以帮助医生及时评估心肌损伤的程度。
五、其他原因除了上述常见原因外，一些其他心脏疾病（如心肌肥厚、心肌病变等）、代谢性疾病（如甲状腺功能亢进症）、药物（如一些药物的不良反应）等都可能导致CK-MB水平的升高。
当发现患者CK-MB水平异常升高时，医生需要结合病史、临床表现和其他辅助检查综合分析，以明确引起CK-MB偏高的具体原因。
CK-MB水平升高可能是心肌损伤或疾病的表现。
通过检测CK-MB水平，可以帮助医生判断心肌损伤的程度和范围，从而指导临床治疗。
但需要注意的是，CK-MB水平的升高并不一定说明患者一定存在心肌损伤，因此在临床实践中，医生需要综合分析，排除其他可能的干扰因素，以准确判断患者的病情。
在治疗上，针对引起CK-MB水平升高的具体原因采取相应的治疗措施非常重要。
血清肌酸激酶同工酶测定标准操作规程
33、血清肌酸激酶同工酶测定标准操作规程1 检验申请单独检验项目申请：血清肌酸激酶同工酶测定(缩写CK-MB), 组合项目申请：血生化中心肌酶谱项目测定。
临床医生根据需要提出检验申请。
2 标本采集与处理2.1标本采集2.1.1常规静脉采血约2 ml，不抗凝，置普通试管中。
或采用含分离胶的真空采血管。
检查体液乳酸脱氢酶的体液标本应用肝素抗凝。
2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。
2.1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。
2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。
专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。
2.1.5下列标本为不合格标本2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本，或少于0.1ml的血清或血浆。
2.1.5.2对反应吸光度有干扰的标本，包括严重溶血、严重浑浊的标本。
2.1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的。
2.1.5.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。
2.2标本保存2.2.1接收标本后在30min内将标本离心分离出血清。
2.2.2标本保存时间：室温（15～25℃）下可稳定4h，普通冰箱中（2～8℃）稳定8h。
-20℃保存稳定30天。
为避免标本中水分挥发使血清浓缩，对保存时间超过1天的标本均加塞密闭或覆盖湿巾。
2.2.3 已完成测试的标本保持完整的识别号，置4～8℃冰箱内保存7天。
2.3 标本采集的注意事项2.3.1 采血前使受检者保持平静、松弛、避免剧烈活动，24h 不饮酒和12h 以上禁食空腹状态。
2.3.2 注意有无应用影响测试项目的药物。
2.3.3 可以使用肝素抗凝的血液标本。
3 方法原理试剂中抑制CK 同工酶CK-M 的抗体，完全抑制CK-M 的活性而不影响另一种CK 同工酶CK-B 的活性。
CK-B 在两个工具酶的参与下，通过下面三个反应式所表示的反应，最后使NADP 转化成在340nm 波长处有光吸收的NADPH ，在340nm 波长处连续监测NADPH 吸光度的增加速率，推算出CK-B 的活性。
肌酸激酶MB型同工酶测定方法操作规程
肌酸激酶MB型同工酶（CK-MB）测定方法操作规程【产品名称】通用名称：肌酸激酶MB型同工酶（CK-MB）测定试剂盒（免疫抑制法）使用说明书【预期用途】该试剂盒采用免疫抑制法，用于体外定量测定人血清中肌酸激酶MB型同工酶的活力。
【检验原理1CK-MB由CK-M和CK-B亚单位组成。
抗CK-M 抗体完全抑制了CK-MM （肌酸激酶的主要活性局部）和CK-MB 中的CK-M亚单位的活性。
再检测CK的活性为余下的CK-B的活性，相当于一半CK-MB活性。
所以将结果乘以2,为CK-MB 的活性。
【主要组成成份】Ri：咪哩缓冲液100 mmol/L葡萄糖20 mmol/LN-乙酰半胱氨酸（NAC）0.2 mmol/L乙酸镁10 mmol/LEDTA 2 mmol/LNADP 2 mmol/LAMP5 mmol/L己糖激酶>4 U/mL羊抗人多克隆抗体2000U/LCK-MM R2：磷酸肌酸30 mmol/L2 mmol/LADPG-6-PDH >2.8U/mL*不同批号试剂盒各组分请勿混用。
【储存条件与有效期】未开启的试剂盒在2〜8°C保存有效期为一年。
试剂开瓶后应避光保存，在2°C~8°C可稳定30天。
试剂不可冰冻。
【适用仪器】迈瑞BS系列全自动生化分析仪、日立7180型全自动生化分析仪、日立7060型全自动生化分析仪、日立7600P自动生化分析仪、奥林巴斯AU400型全自动生化分析仪、奥林巴斯AU2700型全自动生化分析仪、贝克曼库尔特AU680 型全自动生化分析仪。
假设需自动生化分析仪应用参数，请随时和公司联系。
建议用户在不同仪器上使用本产品时，根据实验室情况进行验证。
【样本要求】新鲜血清或血浆，采集后及时测定，应防止溶血和污染。
样本在2°C ~8 °C保存7天内或25 °C保存24小时活性损失2%。
【检验方法】试剂准备R1：即用液体试剂R2：即用液体试剂测定条件样本管一空白管*试剂和样本量可根据不同生化分析仪要求按比例适当增减。
肌酸激酶同工酶MB测定试剂盒说明书
肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）测定试剂盒（化学发光免疫分析法）说明书【产品名称】通用名称：肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）测定试剂盒（化学发光免疫分析法）英文名称：Creatine kinase MB（CLIA）【包装规格】2×30 人份/盒、2×50 人份/盒、2×100 人份/盒【预期用途】用于体外定量测定人体血清或（和）血浆中肌酸激酶同工酶MB 的含量。
肌酸激酶主要催化高能磷酸键从ATP 转移到肌酸，生成磷酸肌酸。
肌酸激酶是二聚体酶，包括骨骼肌CK-MM，脑组织CK-BB，心肌CK-MB 和线粒体肌酸激酶等四种同工酶形式。
CK-MB 分子量80,000，由两个亚单位组成(每个亚基MW= 40000)：亚单位M 表示肌肉型，亚单位B 表示脑型。
CK-MB 主要存在于心肌组织，占CK 总活性的20%，骨骼肌中也有微量分布。
血清中CK-MB 含量对诊断急性心肌梗死、心肌炎等心肌缺血性疾病有重要意义。
CK-MB 在心肌损伤早期即可出现于循环血中，于心肌损伤后2-6 小时开始升高，在12-24 小时内达到峰值，之后降至正常水平(36–72 小时)，CK-MB 测值的升降伴随ECG 演变和胸痛病史。
CK-MB 含量和时间变化，对评估心肌损伤发病时间、梗死体积以及再灌注后损伤有重要意义。
此外，骨骼肌损伤、横纹肌溶解症及中风等疾病中，也伴随有CK-MB 含量升高。
临床诊断上，CK-MB 经常与肌红蛋白和肌钙蛋白I 联合检测。
在心肌损伤相关疾病诊断上，肌钙蛋白I 特异性强，肌红蛋白和CK-MB 早期敏感性高，三者联合检测可以提高诊断的特异性、敏感性。
【检验原理】肌酸激酶同工酶MB 测定采用双位点夹心化学发光免疫分析法，其采用的技术原理如下：第一步：将样本与包被着CK-MB 单克隆抗体的超顺磁性磁微粒（磁珠）以及CK-MB 单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物添加到反应管中，经过孵育，样本中的CK-MB 和包被在磁珠上的CK-MB 单克隆抗体结合，同时CK-MB 单克隆抗体-碱性磷酸酶标记物与样本中CK-MB 另一位点结合。
肌酸激酶同工酶——MB评估
肌酸激酶同⼯酶——MB评估肌酸激酶同⼯酶——MB评估上海仁济医院检验科肌酸激酶MB同⼯酶（CK-MB）是由M和B亚基构成的杂化型⼆聚体，主要存在于⼼肌细胞的外浆层，是⼼肌酶谱中最有特异性的酶，从80年代起公认为⼼肌酶学诊断的“⾦标准”，应⽤于急性⼼肌梗塞（AMI）的早期诊断[1，2]1979年Gerhardt[3]等⼈⾸次报道⽤免疫抑制原理测定CK同⼯酶，免疫抑制法以其快速、灵敏、定量且可进⾏⾃动分析等优点适合常规检测，随着⽅法与试剂不断改进与完善，1986年国外已有试剂盒供应，但价格昂贵；最近国内研制成功免疫抑制法测CK-MB的试剂盒，本⽂旨在对该试剂盒的特性作⼀评估。
材料和⽅法⼀、标本来源分正常组，AMI组和⾮AMI组，⾮常⼈⾎清来⾃体检健康⼈员，计30例，AMI 组53例，系仁济医院⼼内科病房已确诊为AMI 者，⾮AMI组系⼼内科及其它科门诊病⼈，因胸痛、⼼率失常等初诊疑拟AMI，后经系列观察和酶学检查证实不是AMI患者，共20例。
⾎标本留取后及时分离⾎清检测或将检测⾎清置于-20度冰箱保存⾄测定。
⼆、试剂1. 免疫抑制法检测CK-MB试剂盒：上海北加⽣化试剂有限公司产品（1）R1：含CK-MB抗体的咪唑缓冲液（⽺抗⼈CK-M多克隆抗体抑制剂>2000U/L，100mmol/L的咪唑缓冲液成pH6.7内含葡萄糖20mmol/L，醋酸镁10mmol/L，EDTA 2mmol/L）（2）R2(A)：酶⼲粉。
（AMP 5mmol/L，磷酸肌酸30mmol/L，五磷酸⼆腺苷10mmol/L，NADP2mmol/L，V-⼄腺半胱氨酸20mmol/L，已糖激酶≥2500U/L，G6PDH≥500U/L，ADP 2mmol/L）。
2. 宝灵曼CK-MB试剂盒：对照⽤。
三、仪器HITACHI 7150型⾃动⽣化分析仪波长=340nm四、⽅法本试验在⽇⽴7150⽣化⾃动分析仪器上测定，参数表如下：TESTASSAY CODE SAMPLE VOLUMER1 VOLUMER2 VOLUMEWA VELENGTHCALIB METHOD STD. (1) CONC. –POSZ. STD. (2) CONC. –POSZ. STD. (3) CONC. –POSZ. STD. (4) CONC. –POSZ. STD. (5) CONC. –POSZ. STD. (6) CONC. –POSZ. SD LIMIT DUPLICATE LIMIT SENSITIVITY LIMIT SENSITIVITY LIMIT ABS. LIMIT (INC/DEC) PROZONE LIMIT EXPECTED V ALUE TECH LIMIT INSTRUMENT FACTOR [ CK-MB ][ RATE - A ]:[ 45 ]-[ 50 ] [ 5 ][ 3 ][ 240 ][ 100 ][ NO ] [60 ][ 20 ][ NO ] [ ][ 340 ][ LINEAR ][ 0 ][ 0 ] [ 0.0 ]-[ 1 ][ 65 ]-[ 28 ][ 0 ]-‘[ 0 ][ 0 ]-‘[ 0 ][ 0 ]-‘[ 0 ][ 0 ]-‘[ 0 ][ 0.1 ][ 100 ][ 100 ][ 0 ][ 9000 ][ INCREASE ] [ 0 ][ LOWER ][ 0 ]-[ 25 ][ 100]-[ 1000][ 1.0 ]结果⼀、线性范围取⼀⾼活性CK-MB标本：152.0U/L⽤⽣理盐⽔按1/5、2/5、3/5、4/5、5/5⽐例稀释，测得其相应活性分别为38.0、81.0、111.0、131.0、152.0，作图（见图1）。
CK-MB使用说明书
迈克试剂标准操作程序目录1、临床意义2、检测原理3、样品准备4、试剂4.1、试剂盒组成4.2、试剂准备4.3、试剂稳定性4.4、试剂规格5、操作6、校准6.1、校准品6.2、校准品准备6.3、校准品稳定性6.4、校准周期6.5、校准品定值溯源性与不确定度7、质量控制8、分析性能确认8.1、精密度8.2、可报告范围8.3、抗干扰能力8.4、方法学比较8.5、参考范围9、安全和警告10、参考文献（略）1、临床意义血清中肌酸激酶同工酶（CKMB）活力升高是公认的诊断急性心肌梗死和确定有无心肌坏死的重要指标。
特别是对于心电图无Q波的急性心肌梗死和再发性心肌梗死，血清中CKMB升高具有决定诊断的作用。
2、检测原理肌酸激酶（CK）主要的同工酶包括CKMB、CKBB、CKMM，因为正常血清中几乎无CKBB，抗M亚单位的抗血清可以和CKMM及CKMB中的M亚单位形成抗原抗体复合物，从而完全抑制M亚单位的酶活性，，将测得的CK活性值乘以2则代表CKMB的活性。
肌酸激酶（CK）活性的检测原理是：CK催化磷酸肌酸与二磷酸腺苷(ADP)反应产生三磷酸腺苷(ATP)与肌酸；偶联己糖激酶(HK)及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的催化反应。
HK催化葡萄糖与ATP反应，形成葡萄糖-6-磷酸，G6PDH催化葡萄糖-6-磷酸氧化，形成6-磷酸葡萄糖内酯及NADPH。
NADPH生成的速率代表CK活力。
磷酸肌酸 + ADP−−CK肌酸 + ATP−→ATP + 葡萄糖−−HK葡萄糖-6-磷酸 + ADP−→G66-磷酸-葡萄糖 + NADPH + H+葡萄糖-6-磷酸 + NADP−−−PDH−→−3、样品准备样品为空腹血清样品稳定性：样品应在低温条件下运输保存，样品中肌酸激酶同工酶在2～8℃密闭可稳定2天。
样品要求无溶血。
样品不宜反复冻融，以免影响酶活性4、试剂4.1、试剂组成R1：检测试剂1咪唑缓冲液（pH6.7） 100.0mmol/L醋酸镁 10.0mmol/LN-乙酰半胱氨酸 20.0mmol/L磷酸肌酸 30.0mmol/LADP 2.0mmol/LEDTA 2.0mmol/LAMP 5.0mmol/LG-6-PDH >1.5KU/LHK >2.5KU/L羊抗人CK-M抗体（抑制能力>2KU/L）R2：检测试剂2NADP 2.0mmol/L葡萄糖 20.0mmol/L4.2、试剂准备R1试剂为即用型液体试剂,开瓶装载即可使用。
肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定标准操作规程
肌酸激酶同工酶（CK-MB ）测定标准操作规程1.检验原理：（免疫抑制法）用抗人CK-M 抗体与病人血清共同温育，血清中的CK-M 亚单位全部被抑制，再用测定空白扣除血清中残余的腺苷激酶（AK ），测定剩余的非M-CK 活力，即代表C-BB 和CK-MB 中的B-亚基活力。
由于健康人和心脏、肌肉疾患病人血清中CK-BB 的含量极低，一般忽略不计，此等病人的非M-CK 活力实际上代表CK-MB 中的B 亚基活力。
非M-CK 活力测定方法如下：在抑制CK-M 亚单位后，磷酸肌酸和腺苷-5-二磷酸二钠（ADP.2a N ）在肌酸激酶作用下，生成肌酸和腺苷-5-三磷酸二钠（ATP.2a N ）。
ATP 和葡萄糖在己糖激酶（HK ）催化下，生成6-磷酸葡萄糖（G6P ）.G6P 在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下脱氢，同时使氧化型辅酶Ⅰ（+NAD ）还原成还原型辅酶Ⅰ（NADH ），后者引起340nm 吸光度的增高。
在340nm 监测NADH 的生成量，即可计算出非M-CK 的活力。
CK-M 亚单位+抗人CK-M 抗体−→−抗体-抗原复合物 磷酸肌酸+ADP −−−→−-CKM 非肌酸+ATP ATP+葡萄糖−−−→−己糖激酶ADP+6-磷酸葡萄糖 6-磷酸葡萄糖++NAD −−−→−PDHG 66-磷酸葡萄糖酸+NADH++H 2.试剂主要组成成分3.样本要求：静脉采血后立即分离血清。
新鲜无溶血血清。
在22～25℃保存8小时，2～8℃保48小时，-20℃可保存1年。
样本不可反复冻融！4.检验方法；仪器法（详见DF-603/DI-600标准操作规程）5参考范围：6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%（W/V）的氯化钠溶液稀释样本。
建议最大稀释不超过10倍10-6.2.单位换算：ukat/L=U/L×16.67×37.检验结果的局限性7.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
艾威德 AS-420 AS-660 AS-1200 肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定试剂盒（免疫抑制
肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定试剂盒（免疫抑制法）说明书【产品名称】肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定试剂盒（免疫抑制法）【包装规格】a)试剂1：2×40mL试剂2：1×20mLb)试剂1：4×60mL试剂2：2×30mLc)试剂1：2×80mL试剂2：2×20mLd)试剂1：6×40mL试剂2：2×30mL【预期用途】用于体外定量测定人血清中肌酸激酶MB型同工酶的活性。
血清中CK-MB是心肌特异性酶，用于心肌梗死早期诊断。
另外还见于各类型的心脏术后、进行性肌营养不良等。
目前在临床上测定肌酸激酶同工酶主要用于诊断心肌梗塞的辅助诊断[1]。
【检验原理】试剂中加入CK-M的抗体，它能完全抑制CK-M亚基而不影响CK-B亚基的活性。
利用CK的测定原理进行检测即：肌酸磷酸与腺苷二磷酸在肌酸激酶的作用下生成肌酸和腺苷三磷酸，腺苷三磷酸与葡萄糖在己糖激酶的作用下生成葡萄糖－6－磷酸和腺苷二磷酸，葡萄糖－6－磷酸与氧化型辅酶Ⅱ在葡萄糖－6－磷酸脱氢酶作用下生成6－磷酸葡萄糖酸和还原型辅酶Ⅱ。
还原型辅酶Ⅱ在340nm处有特异吸收，通过测定还原型辅酶Ⅱ生成的速率可计算出CK－B亚基的活性。
其结果乘以2即可得出CK-MB的活性。
【主要组成成分】试剂1主要组分缓冲液100mmol/L HK（己糖激酶）≥2KUG-6-PDH（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）≥1.5KU NADP+（氧化型辅酶）2mmol/L NAC（N乙酰半胱氨酸）20mmol/L ADP（腺苷二磷酸钾）2mmol/L二腺苷-5-磷酸10μmol/L葡萄糖20mmol/L抑制CK-MM的抗体≥2KU试剂2主要组分缓冲液100mmol/L肌酸磷酸30mmol/L葡萄糖20mmol/L注：不同批号试剂盒中各组分未经试验不可互换。
【储存条件及有效期】1.试剂原包装在2～8℃储存，有效期为18个月，生产日期、有效期见标签。
Daudit肌酸激酶同工酶MB（CKMB）（学习资料）
肌酸激酶同工酶MB （CK-MB ）测定试剂盒（免疫抑制法）说明书【产品名称】通用名：肌酸激酶同工酶MB （CK-MB ）测定试剂盒（免疫抑制法）英文名：Creatine Kinase Isoenzymes MB （CK-MB ）Assay Kit （Immuno-inhibition Method ）【包装规格】a) R1：2×50ml ，R2：2×10ml ；b) R1：3×50ml ，R2：3×10ml ；c) R1：4×60ml ，R2：4×12ml ；d) R1：2×60ml ，R2：2×12ml ；e ）R1：6×21ml ，R2：2×14.6ml ；f ）R1：4×60ml ，R2：4×15ml ；g ）R1：4×25ml ，R2：4×5ml ；h ）R1：1×50ml ，R2：1×10ml ；i ）R1：12×20ml ，R2：12×4ml ；j ）R1：2×200ml ，R2：2×40ml ；k ）R1：1×45ml ，R2：1×9ml 。
【预期用途】本试剂盒属于体外诊断试剂，用于定量检测人血清或血浆中肌酸激酶同工酶MB （CK-MB ）活性。
【检验原理】肌酸激酶（CK ）同工酶根据亚单元的不同，可分为CK-MB 、CK-MM 等，用特殊的抗CK-M 的抗体使血清中CK-M 亚单位全部被抑制，但不影响B 亚单位的活性。
样本中CK 的B 亚单位可催化磷酸肌酸（CrP ）转变为肌酸（Cr ），同时ADP 磷酸化为A TP ，然后进行酶偶联反应，最终使NADP +转变成NADPH ，通过监测NADPH 上升的速率，计算样品中CK-MB 的活性。
CrP + ADP−→−CK Cr + A TPA TP + 葡萄糖 −→−HK 葡萄糖-6-磷酸 + ADP葡萄糖-6-磷酸 + NADP + −−→−G6PD 6-磷酸葡萄酸 + NADPH + H + 【主要组成成份】原包装的试剂盒在2℃～8℃避光保存，有效期为18个月。
人肌酸激酶同工酶MBCK
人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)酶联免疫分析试剂盒使用方法检测范围：96T1 ng/ml -40 ng/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)水平。
用纯化的人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)，再与HRP标记的肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)浓度。
试剂盒组成1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，组织及相关液体样本中肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)水平。
用纯化的人肌酸激酶同工酶MB抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入CK-MB，再与HRP标记的CK-MB抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的CK-MB呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：135U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90U/L，60U/L，30U/L，15U/L，7.5U/L）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批间应分别小于9%和15%检测范围：5U/L-100U/L保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月FOR RESEARCH USE ONLY Human Creatine Kinase MB isoenzymeDrug NamesKit.. Generic Name：Human Creatine Kinase MB isoenzyme(CK-MBCK-MB))ELISA Kit PurposeThis kit allows for the determination of CK-MB in Human serum,Ttissue,and other biological fluids.Principle of the assayT he kit assay Human CK-MB level in the sample，use Purified Human CK-MB antibody to coat microtiter plate wells,make solid-phase antibody,then add CK-MB to wells,Combined CK-MB which With HRP labeled,become antibody-antigen-enzyme-antibody complex,after washing Completely,Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed,reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of450nm.The concentration of CK-MB in the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.Materials provided with the k itMaterials provided withthe kit48determinations96determinations Storage User manual11Closure plate membrane22Sealed bags11Microelisa stripplate112-8℃Standard：135U/L0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃Standard diluent 1.5ml×1bottle 1.5ml×1bottle2-8℃HRP-Conjugate reagent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Sample diluent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Chromogen Solution A3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Chromogen Solution B3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Stop Solution3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃wash solution （20ml×20fold）×1bottle（20ml×30fold）×1bottle2-8℃Specimen requirements1.serumserum--coagulation at room temperature10-20mins，centrifugation20-min at the speed of 2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.2.plasmaplasma--use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix10-20 mins,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.3.Urine-collect sue a sterile container,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.4.cell culture supernatant-detect secretory components,collect sue a sterile container,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,detect the composition of cells,Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）,Cell concentration reached1million/ml,repeated freeze-thaw cycles,damage cells and release of intracellular components,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.5.Tissue samples-After cutting samples,check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）,Rapidlyfrozen with liquid nitrogen,maintain samples at2-8℃after melting,add PBS（PH7.4）,Homogenized by hand or Grinders,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant.6.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature,and should be experiment as soon as possible after the extraction.If it can’t, specimen can be kept in-20℃to preserve,Avoid repeated freeze-thaw cycles.7.Can’t detect the sample which contain NaN3,because NaN3inhibits HRP active.Assay procedure1.Dilute and add sample to Standard:set10Standard wells on the ELISA plates coated,add Standard100μl to the first and the second well,then add Standard dilution50μl to the first and the second well,mix;take out100μl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately.then add Standard dilution50μl to the third and the forth well,mix;then take out50μl from the third and the forth well discard,add50μl to the fifth and the sixth well,then add Standard dilution50μl to the fifth and the sixth well,mix;take out50μl from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well,then add Standard dilution50μl to the seventh and the eighth well,mix;take out50μl from the seventh and the eighth well and add to the ninth and the tenth well,add Standard dilution50μl to the ninth and the tenth well,mix,take out50μl from the ninth and the tenth well discard(add Sample50μl to each well after Diluting,(density:90U/L，60U/L，30U/L，15U/L，7.5U/L)2.add sample：Set blank wells separately(blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent,other each step operation is same).testing sample well.add Sample dilution40μl to testing sample well,then add testing sample10μl(sample final dilution is 5-fold),add sample to wells,don’t touch the well wall as far as possible,and Gently mix.3.Incubate:After closing plate with Closure plate membrane,incubate for30min at37℃.4.Configurate liquid:30-fold(or20-fold)wash solution diluted30-fold(or20-fold)with distilled water and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane,discard Liquid,dry by swing,add washing buffer to every well,still for30s then drain,repeat5times,dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent50μl to each well,except blank well.7.incubate：Operation with3.8.washing：Operation with5.9.color：Add Chromogen Solution A50ul and Chromogen Solution B to each well,evade the light preservation for15min at37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well,Stop the reaction(the blue color change to yellow color).11.assay：take blank well as zero,Read absorbance at450nm after Adding Stop Solution and within15min.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced15-30minutes inthe room temperature,ELISA plates coated if has not use up after opened,the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation,it can be heated the water helps dissolvewhen dilute.Washing does not affect the result.3.add Sample with sampler Each step,And proofread its accuracy frequently,avoids theexperimental error.add sample within5mins,if the number of sample is much, recommend to use Volley.4.if the testing material content is excessively higher(The sample OD is bigger than the firststandard well),please dilute Sample(n-fold),Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.5.Closure plate membrane only limits the disposable use,to avoid cross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly,The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8.All samples,washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.9.Do not mix reagents with those from other lots.CalculateAssay range5U/L -100U/LStorage and validity1．Storage ：2-8℃.2．validity ：six months.Take the standard density as the horizontal,the OD value for the vertical ,draw the standard curve on graph paper,Find out the corresponding density according to the sample OD value by the Sample curve,multiplied by the dilution multiple,or calculate the straight line regression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with the sample OD value in the equation,calculate the sample density,multiplied by the dilution factor,the result is the sample actual density.This chart for reference only。