关于研究蛋白质细胞定位的几种方法

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体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的 樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗 粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫 电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物 学的各个方面，并取得了可喜的进展。胶体金是 由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下， 聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成 为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。免疫胶体 金标记电镜技术广泛应用于细胞及组织内蛋白 的定位研究，是利用胶体金在碱性环境中带负电
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a-β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基 结合。这样 GFP 分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环 酮生色团，该过程可自动催化合成。GFP 晶体结 构()显示，蛋白中央是一个圆柱形水桶样结构， 长 420nm,宽 240nm，由 11 个围绕中心 a 螺旋的 反平行β折叠组成，荧光基团的形成是从这 个螺旋开始，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖， 底部由 1 个短的垂直片段覆盖，生色团位于大空 腔内。
用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗 原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞化学 技术。 S.pagny 等(2003)将 XYIT36:GFP 转入拟南 芥，检测发现荧光出现在高尔基体。使用植物 Lewis(高尔基体标志分子)抗体以及 BIP(内质网 标志分子)抗体进行免疫荧光标记，发现 GFP 的 绿色荧光与使用 Lewis 抗体所做的免疫荧光存在 共定位，而与 BIP 分布在不同部位。说明 XYIT36:GFP 定位在高尔基体。3GFP 及其在生命 科学研究中的应用 3.1 简介 GFP 海洋生物发光是
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种荧光抗体作为分子探针检查细胞或组织内的 相应抗原。在细胞或组织中形成的抗原或抗体复 合物上含有各种颜色的荧光素，利用荧光显微镜 观察标本，荧光素受激光的照射而发出各种颜色 的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而 确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技 术测定含量。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的 方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示 踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种 方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常
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个非常普遍的现象。从原生生物到脊椎动物均有 生物发光，如海萤，磷虾，腔肠动物等。从不同 动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相 同，不同动物荧光发生机制有很大差别。多管水 母体内存在两种发光蛋白绿色荧光蛋白:GFP 和 aequorin。当 aequorin 与 3 个 Ca2+结合后，即 发生氧化反应并发射蓝光，最大发射波长 469nm。 GFP 被紫外光或蓝光激发后发出绿色荧光。发光 机制如下:
关键词：蛋白质细胞定位细胞定位免疫荧光 免疫胶体金标记 GFP 真核细胞具有复杂的亚细胞 结构，已发现数十种细胞器，每种细胞器都有一 组特定的蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少 量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内 质网合成，最终运送到不同地点，形成成熟蛋白 并行使功能。译产物中很大一部分是以前体蛋白 形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋 白在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，是 细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研
的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。 电镜水平的免疫金染色是目前较理想的免疫定 位方法，具有特异性强、灵敏度高、定位准确和 具有双重标记功能等优点。例如用连有 15nm 金 颗粒的 GFP 单克隆抗体以及连有 lOnm 金颗粒的 过氧物酶体的标志酶抗体作为一抗进行免役金 标 ， 证 明 CAT1-GFP 定 位 在 过 氧 物 酶 体 (AkaneKamigakieta1.,2003)。 2 免疫荧光根据抗 原与抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标 记上荧光素制成荧光标记物荧光标记物，再用这
究的热门话题。了解某些蛋白质的定位从而分析 探索其生物学功能，意义重大。目前，这方面的 己取得很大进展。细胞器不同，相应的靶向蛋白 的定位过程也不同。研究蛋白的亚细胞定位可采 取多种方法：免疫胶体金标记；免疫荧光；与 gfp 构建融合基因，用荧光显微镜观察;蔗糖密度梯 度离心;多糖序列分析等。以下介绍免疫胶体金 标记、免疫荧光、与 gfp 构建融合基因等常用方 法。1 免疫胶体金标记金标法是 Faulk 和 Taylor 提出的，并首先用于免疫电镜。当用金标记的抗
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GFP 在水母体内的发光机制 GFP 由 gfp 基因
编码，具有 238 个氨基酸残基的多肽单体，分子 量约 27kD。GFP 有两个吸收峰，最大吸收峰在 395nm，在 475nm 还有一个吸收峰，前者由紫外 光激发，后者由蓝光激发。发射光谱也有两个峰 值:509nm 和 540nm,呈绿色或黄绿色荧光。 GFP 荧 光的产生主要归功于分子内第 65,66,67 位丝氨 酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出 的蛋白折叠环化后，在 O2 存在下分子内第 67 位 甘氨酸的酰基对第 65 位丝氨酸的羧基的亲核攻 击形成第 5 位碳原子咪唑基，第 66 位酪氨酸的。
GFP
的
晶
体
结
构
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