荧光定量PCR原理及操作步骤

三个关键词： 三个关键词： 实时，定量， 实时，定量，荧光
PCR分四个阶段
如何定量？ 如何定量？
• Ct值的概念 Ct值的概念 • Ct值的定义是 值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号 扩增过程中， 值的定义是 扩增过程中 开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对 应的循环次数 循环次数。 应的循环次数。
• 基因型分析
SYBR Green I 优点
SYBR Green I 缺点
PCR程序指南
UNG酶使用原理
金牌Tag酶活性
参比荧光：管家荧光ROX
ROX校正效果 校正效果
96孔板设置举例
PCR曲线
标准曲线
定量原理
确定初始模板的浓度
DNA量越多 量越多, 初始 DNA量越多, 荧光 达到某一值（域值） 达到某一值（域值）时 所需要的循环数越少 Log浓度与循环数呈线 Log浓度与循环数呈线 性关系， 性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数就可 计算出样品中所含的模 板量
起点定量与终点定量
百度文库 荧光化学
①actin ③achi ⑤aly ②actin ④achi ⑥aly
⑦vlg ⑧vlg
⑨stat ⑩stat
定量与常规PCR的差别 定量与常规PCR的差别
• 常规 常规PCR技术： 技术： 技术 • 对PCR扩增反应 扩增反应 终产物进行定 的终产物进行定 量及定性分析 定量PCR技术： 技术： 定量 技术 通过对PCR扩增反 通过对 扩增反 应中每一个循环产 应中每一个循环产 荧光信号的 信号的实时 物荧光信号的实时 检测从而实现对 从而实现对起 检测从而实现对起 始模板定量及定性 始模板定量及定性 的分析
TaqMan
SYBR Green 1
TaqMan
SYBR Green I 工作原理
• 。 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位
• SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光
AC G T GCA C T G T A G G A T G G T GT C A G CA A AT C A CC CCT
变性: 变性: 无荧光信号
AC GA CT TA GG C AT C C A GT C GT C A G
AG GAT
G TG CAC
T GC TG AT
未结合SYBR Green 1 dye
C CTA
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量 • 融解曲线分析
– -----可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
荧光定量PCR real time-PCR
定量PCR反应体系 反应体系 定量
模板cDNA Tag mixture 引物1 引物2 H20 4ul 10ul 0.5ul 0.5ul 5ul 1♀
模板
2♂
模板 686.75 ng/ul 26.47 ng/ul
①③⑤⑦⑨ ②④⑥⑧⑩
443.45 ng/ul 17.738 ng/ul