细胞培养技术ppt课件

? 细胞培养过程
准备工作
细胞信息、 培养基、耗材
复苏（快）
实验 传代（无菌）
冻存（慢）
方法
冻存液成分、 程序
? 注意无菌操作（全程）
细胞计数
? 血细胞计数器：手工计数细胞
细胞计数
计算公式：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×稀释倍数× 104
细胞计数
注意事项
? 记上不记下，记左不记右。 ? 吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满
步骤）
消毒灭菌方法
? 物理消毒灭菌法 ? Co60辐射（ γ射线） ：破坏生物大分子（塑料制品）
? 紫外线（200-300 nm）：30min，阻止细菌、病毒 核酸合成。（细胞室：用于空气，操作台表面等）
? 湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min，破坏微 生物孢子、蛋白变性。（ 用于大量液体、玻璃器皿、 部分塑料耗材、手术器械等，由工作人员操作）
速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓 冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞 外形成冰晶，减少胞内冰晶对细胞的损伤。）
2 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ ? 冷冻管内细胞数目一般为1-8x106 cells/ml
缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。
小结三 清洗及灭菌
?需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 ?清洗的步骤
?灭菌的方法： -紫外线（超净台、生物安全柜） -高压蒸汽灭菌（准备好放在准备室502） -75%酒精（表面消毒，小心酒精灯明火）
四 细胞培养
? 生长类型 ? 细胞来源 ? 细胞复苏 ? 细胞传代
? 细胞冻存 ? 细胞计数 ? 活力测定 ? 污染种类
酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）； 酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）， 涉及到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。
缓冲液（洗涤细胞）
PBS：磷酸缓冲盐溶液——具有pH缓冲作用的等渗盐溶 液 （常规实验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl 和KCl）
D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离 子，用于胚胎学方面的研究。
慢解冻、融解 。使用时，必须将解冻的血清 充分 混匀，并且勿将血清置于37℃太久。
青霉素-链霉素溶液
青霉素的工作浓度为100 U/ml，
链霉素的工作浓度为0.1 mg/ml。
分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质的组成，达到 抑制细菌生长的作用，防止污染，对真菌和支原体无 效。
其他实验所需的试剂： 药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子 （如SCF）等
? 血清（作用、存储及解冻方法）
? 试剂标签要规范
三 清洗及灭菌
?在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感, 均能影响培养细胞的生长
? 微生物产品附带杂物 ? 上次细胞残留物 ? 非营养成分的化学物质
?需要清洗的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 （包括：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个
血清
提供基本营养物质、激素和各种生长因子、 提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴 壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保 护作用。
? 保存血清最好的方法？ 建议血清保存在 -20℃。解冻后存放于 4℃时，请 勿超过一个月。 （分装）
? 如何解冻血清才不会使产品质量受损? 建议从冷冻箱取出后，置于 2～8℃冰箱使之 缓
? MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞 毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。
细胞培养的污染类型
? 细菌污染 ? 真菌污染 ? 支原体污染 ? 病毒污染 ? 非同种细胞污染 ? 化学污染
中起调节及控制作用
培养基分类
美国模式培养物集存库 ATCC
?DMEM（高糖，葡萄糖4500 mg/L ）：成纤维、 上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原 代神经元
?DMEM（低糖，葡萄糖1000 mg/L ）：间充质 干细胞，单抗细胞融合
?RPMI 1640： 血液细胞（HL60）、一些实体瘤 细胞（BT474）
悬液，注意盖片下不要有气泡。 ? 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞
计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制 备细胞悬液。
培养细胞活力测定
? 细胞活力测定是体外实验研究中应用最广的 技术手段之一。
? 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细 胞组成，从 形态上区别 死、活细胞是 困难的。
液氮罐
液氮：-196 ℃
纯水仪
压力蒸汽灭菌器 电热干燥箱
由工作人员操作，注意安全！
小结一 实验设备及功能
?超净工作台，生物安全柜------操作平台 （酒精灯安全） ?CO2培养箱-------------------------细胞生长的空间 ?倒置显微镜-------------------------观察细胞 ?离心机-------------------------------离心收集细胞 ?电热恒温水槽----------------------加热 ?液氮罐-------------------------------冻存细胞 ?纯水仪-------------------------------制备一级水 ?压力蒸汽消毒器--------------------灭菌 ?电热干燥箱 -------------------------烘干器皿
细胞传代
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱 和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量 扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方 法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必 经过程。
细胞传代
1 悬浮细胞传代
? 离心法传代 ：离心（ 1000转/分）去上清，沉淀物加新
培养液后再混匀传代。
细胞的生长类型
? 粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 （绝大多数正常细胞及实体瘤细胞）
? 悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态 下即可生长的细胞。（主要是白血病细胞等）
小鼠单核巨噬细胞
白血病细胞
细胞贴壁过程
每代贴壁细胞的生长过程
? 游离期（接种后在培养液中呈悬浮状态，细胞质回缩，细 胞体圆球形）
? 干热：160℃, 2 小时，高热作用下的氧化作用破坏 微生物（耐高温的玻璃和金属制品）
? 过滤：0.22μm滤膜过滤除菌（少量试剂）
消毒灭菌方法
? 化学消毒灭菌法 ? 75%酒精 ? 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内 的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）
? 1‰新洁尔灭 ? 主要用于器械的浸泡，皮肤和操作室壁面的擦试 消毒（阳离子表面活性剂，能破坏细胞膜，改变 其通透性而起杀菌作用）
Hanks：平衡盐溶液——无机盐和葡萄糖浓度接近大部 分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养(几个 小时)。
D-Hank's：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液 时） 。
消化液
? 胰蛋白酶溶液 使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。 配制时要用 不含Ca2+ 、Mg2+ 及血清（对胰酶产生抑制作
用）的平衡盐溶液（如PBS、D-Hank's）。 ? EDTA溶液
一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要Ca2+ 、Mg2+ 来保持其完整性， EDTA可以螯合这些离子 ，可使细胞之间 裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为 0.02%，以无钙、 镁的平衡盐溶液配制 。 ? 胶原酶溶液
主要 水解结缔组织中胶原蛋白 成分（用胰蛋白酶效果较 差），使用 Hanks溶液配置，常用剂量为最终浓度 200U/ml （约为1mg/mL）。
（悬浮细胞没有贴壁过程）
细胞来源
? 国内可以买到细胞株的地方有哪些？ ? ATCC（美国模式培养物集存库）国内代理 ? ECACC（欧洲细胞株、微生物保藏中心）国内代理、
sigma ? 中国科学院细胞研究所 ? 中国医学科学院（协和医科大学）基础医学部 ? 武汉大学冷藏中心等
准备工作
? 确定细胞株的培养信息（ ATCC） ? 配制培养基（基础培养基 +10%胎牛血清+双
二 试剂及耗材
? 培养基 ? 缓冲液 ? 消化液 ? 血清 ? 其他
o 耗材
培养基
供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细 胞生长和繁殖的生存环境。
成分及作用： ? 氨基酸：组成蛋白质的基本单位 ? 碳水化合物：能量来源 ? 无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡 ? 维生素：维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢
细胞冻存
3 慢冻程序
n传统方法：4℃ 10分钟→ -20℃ 30 分钟 → -80℃ 16－18 小时（或过夜）→液氮长期保存。 n程序降温盒：利用异丙醇实现梯度降温（易挥发，并且易 吸收空气中的水分，冷冻过程中可以辅助实现缓慢降温， 每十分钟降一度）。
细胞冻存
小结四 细胞培养过程
? 细胞生长类型及传代方法
试剂标注规范
百度文库
? 试剂名称 ? 配制浓度 ? 配制人 ? 配制日期
NaCl 0.5 mM 张三 2016.10.21
耗材
? 培养皿、瓶、孔板 ? 离心管、移液管 ? 枪尖 ? 其他
小结二 试剂及耗材的分类及用途
? 培养基（成分、分类）
o 耗材（分类、用途）
? 缓冲液 （PBS、Hanks等）
? 消化液（分类及应用）
抗）、胰酶、 PBS ? 无菌培养瓶、吸管、离心管的准备
细胞复苏（快融）
（l）从液氮中取出冷冻管， 迅速投入 37℃水浴中，使其 融化（1分钟左右）。并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。
（2）用培养液稀释后低速离心10分钟。 （3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 （4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。
? 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活性。
培养细胞活力测定
3 四唑盐（MTT）比色法
? 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。
? 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的 蓝紫色产物（ formazan)，并沉淀在细胞中，而死细 胞没有这种功能。二甲亚砜（ DMSO）能溶解沉积在 细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。
一 实验设备
?超净工作台，生物安全柜 ?CO 培养箱
2
?倒置显微镜 ?离心机 ?电热恒温水槽 ?液氮罐 ?纯水仪 ?压力蒸汽消毒器 ?电热干燥箱
超净台
生物安全柜
酒精灯（√），离开要熄灭 ！
酒精灯（×）
CO2培养箱
?37C℃O2，培5养％箱CO设定。的条件为 2
倒置显微镜
离心机
配平
电热恒温水槽
? 贴壁期（细胞平均在10分钟－4小时贴壁，底物：胶原、玻 璃、塑料、其它细胞等）
? 潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，一般为6～24小时 ? 对数生长期（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。
最适合进行实验研究） ? 停止期（平台期）（细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不
再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）
细胞培养技术
什么是细胞培养？
? 细胞培养也叫细胞克隆技术。
? 通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。 因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培 养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
主要内容
? 实验设备 ? 试剂及耗材 ? 清洗及灭菌 ? 细胞培养
（细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、 传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污 染）
? 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶底时，将上清培养液去 除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传 代。
离心
新鲜培养基悬浮 铺板
2 半贴壁细胞传代（Hela细胞） ? 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直
接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
细胞传代
细胞冻存（慢冻）
1 细胞冻存液（1ml/管） ? 基础培养基70％ ? 胎牛血清20％ ? DMSO 10％ （二甲基亚砜，一种渗透性保护剂，可迅
培养细胞活力测定
1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞 群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表示细胞 的增殖能力。
n 克隆形成率＝（克隆形成数／接种细胞数）×100% n 优点：精确、可靠，适于贴壁细胞
培养细胞活力测定
2 台盼蓝法（0.4%）
? 细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与 解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进 入细胞内。故活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。