鸭梨黑斑病
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CTAB ( C etyltriethylammonium Brom ide)法 [3]。 1. 3. 2 PCR 扩增
PCR反应体系: 10 @ PCR 缓冲液 5 LL、dNTP 2. 5 mmol/L 1 LL、引 物 10 mmol /L 1 LL、Taq 酶 1U、模板 DNA 0. 1 Lg, 加双蒸馏水至 50 LL。空白 对照不加任何 DNA 模板。选用王洪凯等 [ 4] 报道的 1对引物 ITS1和 ITS4扩增核糖体基因 ITS1- 5. 8S
azhuang 050071, China; 4. Shenzhen Exit and Entry Inspect ion and Quaran tine Bareau)
A bstra ct In this art icle, the type ofAlterna ria separated from pear ofH ebei and X injiang of Ch ina, and U SA,
) 2)
rDNA - ITS2区, 正向引物 ITS1序列为 5. - TCCG2 TAGGTGAACCTGCGG- 3. ; 反向引物 ITS4 序列为 5. - TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3. 。扩增程序: 94 e 变性 5 m in; 94 e 30 s, 55 e 30 s, 72 e 30 s, 35个循环; 72 e 延伸 7 m in。 表 1 部分链格孢菌 ITS序列的 GenBank登记号
子种彼此间及大孢子种与小孢子种间已发生明显分化, 可以根据 ITS序列差异明确区分。而供试的多数小
孢子种在 ITS序列上差异很小, 因而不能根据 ITS序列差异来区分。
关键词 梨 链格孢 形态 ITS
中图分类号 S436, S41- 33
由链格孢引起的梨果实上的黑斑病是重要的 种的表面具黑斑症状的梨进行病原菌分离鉴定研
my and Biotechnology, China Agricu lture U niversity, Be ijing 100193, China; 2. Ch inese A cademy of Inspec2
tion and Q uarant ine, Be ijing 100029 Ch ina; 3. H ebe i Exit and En try Inspection and Quarant ine Bureau, Shiji2
AF314571 AF314583 AF314588 AF314756 AY154716
16 Alternaria solani ( E llis et Martin ) Sorauer 17 Alternaria tenuissim a ( Fr. ) W iltsh ire 18 Alternaria tenuissim a ( Fr. ) W iltsh ire 19 Alternaria zinn ia eM. B. E llis 20 Lewia infectoria E. G. Simm ons
GenBank 登记号 AJ853759 AY625056 AF392983 AY372686
5 Alternaria brassicicola ( Schw. ) W iltsh ire 6 Alternaria brassicicola ( Schw. ) W iltsh ire 7 Alternaria gaisen K. Nagano 8 Alternaria gaisen K. Nagano 9 Alternaria long ipes ( E l.l et Ev. ) Mason 10 Alternaria long ipes ( E l.l et Ev. ) Mason
年收集了河北部分鸭梨果园冷库中储存的具链格 梨 (品种: d. An jou ) 40个, 从美国购买的产自智利
孢侵染症状的果实, 并从市场上购买了部分其他品 的表面有腐烂症状的梨 (品种: Conference) 8个, 从
基金项目: 国家质检总局科研项目 / 鸭梨黑斑病病菌疑似种、近似种的鉴定 0 (编号: 2006 IK 205 )。 * 通讯作者 Em ai:l cyshen@ cau. edu. cn; yan jin@ caiq. org. cn 收稿日期: 2009- 03 - 31
AF392986 AF392985 AF314581 AY762944 AY293867 AF314587
11 Alternaria long ipes ( E l.l et Ev. ) Mason 12 Alternaria p om icola A. S. H orn e 13 Alternaria sesam icola (Kawam ura) Mohanty et Behera 14 Alternaria solani ( E llis et Martin ) Sorauer 15 Alternaria solani ( E llis et Martin ) Sorauer
供试菌株在 PDA 平板上培养 3~ 5d后, 从菌 落边缘取 菌丝块并 进一步切 成极细的 小块, 移到 50mL马铃薯 - 葡萄糖培养液中, 25 ? 0. 5e 条件下 摇床 150r/m in震荡培养 2d, 经滤纸抽滤菌丝, 用无 菌水冲洗 3次后, 用灭菌吸水纸吸去多余的水份, 置于 - 20e 冰箱中保存备用。 1. 3. 1 总 DNA 提取
been occurred among large- spored Alternaria spec ies and between large- spored and small- spored Alternaria
spec ies, which cou ld be dist inguished clearly based on the d ifferen t of ITS sequences. W hile there is very sma ll
储藏期病害, 在果实表面造成近圆形或不规则形黑 究, 试图从病原形态和分子生物学方面进一步明确
褐色病斑, 中间凹陷, 潮湿时病斑表面生黑色霉层, 引起鸭梨黑斑病病原菌的种类, 并分析比较部分国
影响水果的质量和商品价值。 2004 年美国和加拿 家梨上的链格孢和我国梨上链格孢的种类差异。
大曾以中国出口鸭梨上发现链格孢新种 (Alterna ria 1 材料和方法
) 1)
2009年第 5期
植物检疫 PLANT QUARANTINE
Vo.l 23 No. 5
香港购买的日本梨 (品种: 20世纪 ) 19个, 分别从果 实上分离病原菌。在梨上病斑周围的病健交界处
及果柄表面用 70% 酒精擦洗消毒, 用解剖刀去除表 皮, 取果肉腐烂部分平铺在滤纸培养基上; 取果柄 靠近基部的一段 纵向剖开 后在滤纸 上均匀摆 好。
置于培养箱中, 12h光照, 12h黑暗, 并在 25 ? 0. 5e 的条件下培养 3~ 5d。将出现链格孢菌的培养皿置 于实体显微镜 ( 50 倍 )下观察, 用解 剖针挑取具有 典型产孢结构的单根孢子链上的孢子转接于马铃 薯 - 胡 萝 卜 培 养 基 ( PCA: 马 铃 薯 200g, 胡 萝 卜 200g, 琼脂 15g, 蒸馏水 1000mL) [ 1] 平板上。将平板 置于上述光照和温度条件下培养 5~ 7d。 1. 2 形态鉴定
链格孢的培养特性和鉴定在上述 4 种培养基 上进行。将上述培养物在实体解剖镜 50 @下观察 产孢表型。先根据 S immons[ 2] 和 R oberts[ 3] 的描述 确定培养物的产孢表型组, 然后再鉴定种。 1. 3 分子生物学鉴定
从每组产孢表型中分别选取 4~ 10个菌株, 共 28支菌株进行 5. 8S rDNA 及 ITS区序列分析。另 从 GenBank上下载了 20 个 Alternaria 不同 菌种的 ITS序列进行系统发育关系分析 (表 1)。
ya liinficiens)为由暂停中国鸭梨出口。为进一步研 1. 1 病菌分离
究我国梨上的链格孢种类, 为控制黑斑病提供科学
从河北部分果园的冷库中收集到表面有黑斑
依据, 同时比较研究其他国家梨上的链格孢, 防止 症状的鸭梨 60余个, 另从北京市场上购得表面有
具危 险性的链格孢菌传入我国, 本文作者于 2007 腐烂症状的新疆库尔勒香梨 15个, 从香港购美国
序号
菌种
1 Alternaria al terna ta ( Fr. ) Keissler
2 Alternaria al terna ta ( Fr. ) Keissler
3 Alternaria brassicae ( B erk. ) Sacc.
4 Alternaria brassicae ( B erk. ) Sacc.
Japan and Chile was stud ied on sporu lation patterns, conidia characteristics and molecular b iology. A total of
three k inds, namely, Alterna ria a lterna ta, A. tenu issima and A. infectoria were identified after 115 stra ins ofAl2 tern1 ar ia were iden tified by morphology. ITS phylogenetic analysis study showed, obvious differentiations had
分别挑取上述菌落的单个孢子, 转入以下 4种 培养基上: 马铃薯胡萝卜培 养基 ( PCA )、1 /2 马铃 薯胡萝卜培养基 ( 1 / 2 PCA )、干草培养基 (HAY )和 V8培养基 ( V8)上培养, 于 22e 左右、两支 40W 冷 白光 ( 4200k)灯管、8h照射和 16h黑暗交替进行培 养, 灯管距离培养物约 40cm, 培养物面向上, 培养 1 周后观察。
wk.baidu.com
Iden tifica t ion of Alterna ria isola tes from som e Ch inese and for eign pea r fruits. L iu X inwe i1, Chen Yan2, Song Fu3, ZhaoW ensheng3, W u P inshan2, Zhang Gu im ing4, Shen Chongyao1* , Y an Jin2* ( 1. College ofAgrono2
K ey words pear, Alterna ria, morphology, ITS
摘要 本文从链格孢的产孢表型、分生孢子特征和分子生物学方面研究了从河北鸭梨、新疆库尔勒香
梨、美国和日本以及智利的梨上分离的链格孢菌的种类。经对 115支 Alterna ria 菌株的形态学鉴定, 共确定
了 3个种, 即 Alternaria a lterna ta、A. tenu issima 和 A. infectoria。 ITS系统发育分析研究表明, Alterna ria 大孢
d ifference on ITS sequences among the ma jority of tested sm all- spored Alternaria species, therefore strains of
small- spored Alternaria species can not be dist inguished by the d ifference of ITS sequence.
2009年第 5期
植物检疫 PLANT QUARANTINE
Vo.l 23 No. 5
我国梨和部分国外梨果实上链格孢菌的鉴定研究
刘新伟 1 陈 岩 2 宋 福 3 赵文胜3 吴品珊 2 章桂明 4 沈崇尧 1* 严 进 2*
( 1. 中国农业大学农学与生物技术学院 北京 100193 2. 中国检验检疫科学研究院 3. 河北出入境检验检疫局 4. 深圳出入境检验疫局 )
PCR反应体系: 10 @ PCR 缓冲液 5 LL、dNTP 2. 5 mmol/L 1 LL、引 物 10 mmol /L 1 LL、Taq 酶 1U、模板 DNA 0. 1 Lg, 加双蒸馏水至 50 LL。空白 对照不加任何 DNA 模板。选用王洪凯等 [ 4] 报道的 1对引物 ITS1和 ITS4扩增核糖体基因 ITS1- 5. 8S
azhuang 050071, China; 4. Shenzhen Exit and Entry Inspect ion and Quaran tine Bareau)
A bstra ct In this art icle, the type ofAlterna ria separated from pear ofH ebei and X injiang of Ch ina, and U SA,
) 2)
rDNA - ITS2区, 正向引物 ITS1序列为 5. - TCCG2 TAGGTGAACCTGCGG- 3. ; 反向引物 ITS4 序列为 5. - TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3. 。扩增程序: 94 e 变性 5 m in; 94 e 30 s, 55 e 30 s, 72 e 30 s, 35个循环; 72 e 延伸 7 m in。 表 1 部分链格孢菌 ITS序列的 GenBank登记号
子种彼此间及大孢子种与小孢子种间已发生明显分化, 可以根据 ITS序列差异明确区分。而供试的多数小
孢子种在 ITS序列上差异很小, 因而不能根据 ITS序列差异来区分。
关键词 梨 链格孢 形态 ITS
中图分类号 S436, S41- 33
由链格孢引起的梨果实上的黑斑病是重要的 种的表面具黑斑症状的梨进行病原菌分离鉴定研
my and Biotechnology, China Agricu lture U niversity, Be ijing 100193, China; 2. Ch inese A cademy of Inspec2
tion and Q uarant ine, Be ijing 100029 Ch ina; 3. H ebe i Exit and En try Inspection and Quarant ine Bureau, Shiji2
AF314571 AF314583 AF314588 AF314756 AY154716
16 Alternaria solani ( E llis et Martin ) Sorauer 17 Alternaria tenuissim a ( Fr. ) W iltsh ire 18 Alternaria tenuissim a ( Fr. ) W iltsh ire 19 Alternaria zinn ia eM. B. E llis 20 Lewia infectoria E. G. Simm ons
GenBank 登记号 AJ853759 AY625056 AF392983 AY372686
5 Alternaria brassicicola ( Schw. ) W iltsh ire 6 Alternaria brassicicola ( Schw. ) W iltsh ire 7 Alternaria gaisen K. Nagano 8 Alternaria gaisen K. Nagano 9 Alternaria long ipes ( E l.l et Ev. ) Mason 10 Alternaria long ipes ( E l.l et Ev. ) Mason
年收集了河北部分鸭梨果园冷库中储存的具链格 梨 (品种: d. An jou ) 40个, 从美国购买的产自智利
孢侵染症状的果实, 并从市场上购买了部分其他品 的表面有腐烂症状的梨 (品种: Conference) 8个, 从
基金项目: 国家质检总局科研项目 / 鸭梨黑斑病病菌疑似种、近似种的鉴定 0 (编号: 2006 IK 205 )。 * 通讯作者 Em ai:l cyshen@ cau. edu. cn; yan jin@ caiq. org. cn 收稿日期: 2009- 03 - 31
AF392986 AF392985 AF314581 AY762944 AY293867 AF314587
11 Alternaria long ipes ( E l.l et Ev. ) Mason 12 Alternaria p om icola A. S. H orn e 13 Alternaria sesam icola (Kawam ura) Mohanty et Behera 14 Alternaria solani ( E llis et Martin ) Sorauer 15 Alternaria solani ( E llis et Martin ) Sorauer
供试菌株在 PDA 平板上培养 3~ 5d后, 从菌 落边缘取 菌丝块并 进一步切 成极细的 小块, 移到 50mL马铃薯 - 葡萄糖培养液中, 25 ? 0. 5e 条件下 摇床 150r/m in震荡培养 2d, 经滤纸抽滤菌丝, 用无 菌水冲洗 3次后, 用灭菌吸水纸吸去多余的水份, 置于 - 20e 冰箱中保存备用。 1. 3. 1 总 DNA 提取
been occurred among large- spored Alternaria spec ies and between large- spored and small- spored Alternaria
spec ies, which cou ld be dist inguished clearly based on the d ifferen t of ITS sequences. W hile there is very sma ll
储藏期病害, 在果实表面造成近圆形或不规则形黑 究, 试图从病原形态和分子生物学方面进一步明确
褐色病斑, 中间凹陷, 潮湿时病斑表面生黑色霉层, 引起鸭梨黑斑病病原菌的种类, 并分析比较部分国
影响水果的质量和商品价值。 2004 年美国和加拿 家梨上的链格孢和我国梨上链格孢的种类差异。
大曾以中国出口鸭梨上发现链格孢新种 (Alterna ria 1 材料和方法
) 1)
2009年第 5期
植物检疫 PLANT QUARANTINE
Vo.l 23 No. 5
香港购买的日本梨 (品种: 20世纪 ) 19个, 分别从果 实上分离病原菌。在梨上病斑周围的病健交界处
及果柄表面用 70% 酒精擦洗消毒, 用解剖刀去除表 皮, 取果肉腐烂部分平铺在滤纸培养基上; 取果柄 靠近基部的一段 纵向剖开 后在滤纸 上均匀摆 好。
置于培养箱中, 12h光照, 12h黑暗, 并在 25 ? 0. 5e 的条件下培养 3~ 5d。将出现链格孢菌的培养皿置 于实体显微镜 ( 50 倍 )下观察, 用解 剖针挑取具有 典型产孢结构的单根孢子链上的孢子转接于马铃 薯 - 胡 萝 卜 培 养 基 ( PCA: 马 铃 薯 200g, 胡 萝 卜 200g, 琼脂 15g, 蒸馏水 1000mL) [ 1] 平板上。将平板 置于上述光照和温度条件下培养 5~ 7d。 1. 2 形态鉴定
链格孢的培养特性和鉴定在上述 4 种培养基 上进行。将上述培养物在实体解剖镜 50 @下观察 产孢表型。先根据 S immons[ 2] 和 R oberts[ 3] 的描述 确定培养物的产孢表型组, 然后再鉴定种。 1. 3 分子生物学鉴定
从每组产孢表型中分别选取 4~ 10个菌株, 共 28支菌株进行 5. 8S rDNA 及 ITS区序列分析。另 从 GenBank上下载了 20 个 Alternaria 不同 菌种的 ITS序列进行系统发育关系分析 (表 1)。
ya liinficiens)为由暂停中国鸭梨出口。为进一步研 1. 1 病菌分离
究我国梨上的链格孢种类, 为控制黑斑病提供科学
从河北部分果园的冷库中收集到表面有黑斑
依据, 同时比较研究其他国家梨上的链格孢, 防止 症状的鸭梨 60余个, 另从北京市场上购得表面有
具危 险性的链格孢菌传入我国, 本文作者于 2007 腐烂症状的新疆库尔勒香梨 15个, 从香港购美国
序号
菌种
1 Alternaria al terna ta ( Fr. ) Keissler
2 Alternaria al terna ta ( Fr. ) Keissler
3 Alternaria brassicae ( B erk. ) Sacc.
4 Alternaria brassicae ( B erk. ) Sacc.
Japan and Chile was stud ied on sporu lation patterns, conidia characteristics and molecular b iology. A total of
three k inds, namely, Alterna ria a lterna ta, A. tenu issima and A. infectoria were identified after 115 stra ins ofAl2 tern1 ar ia were iden tified by morphology. ITS phylogenetic analysis study showed, obvious differentiations had
分别挑取上述菌落的单个孢子, 转入以下 4种 培养基上: 马铃薯胡萝卜培 养基 ( PCA )、1 /2 马铃 薯胡萝卜培养基 ( 1 / 2 PCA )、干草培养基 (HAY )和 V8培养基 ( V8)上培养, 于 22e 左右、两支 40W 冷 白光 ( 4200k)灯管、8h照射和 16h黑暗交替进行培 养, 灯管距离培养物约 40cm, 培养物面向上, 培养 1 周后观察。
wk.baidu.com
Iden tifica t ion of Alterna ria isola tes from som e Ch inese and for eign pea r fruits. L iu X inwe i1, Chen Yan2, Song Fu3, ZhaoW ensheng3, W u P inshan2, Zhang Gu im ing4, Shen Chongyao1* , Y an Jin2* ( 1. College ofAgrono2
K ey words pear, Alterna ria, morphology, ITS
摘要 本文从链格孢的产孢表型、分生孢子特征和分子生物学方面研究了从河北鸭梨、新疆库尔勒香
梨、美国和日本以及智利的梨上分离的链格孢菌的种类。经对 115支 Alterna ria 菌株的形态学鉴定, 共确定
了 3个种, 即 Alternaria a lterna ta、A. tenu issima 和 A. infectoria。 ITS系统发育分析研究表明, Alterna ria 大孢
d ifference on ITS sequences among the ma jority of tested sm all- spored Alternaria species, therefore strains of
small- spored Alternaria species can not be dist inguished by the d ifference of ITS sequence.
2009年第 5期
植物检疫 PLANT QUARANTINE
Vo.l 23 No. 5
我国梨和部分国外梨果实上链格孢菌的鉴定研究
刘新伟 1 陈 岩 2 宋 福 3 赵文胜3 吴品珊 2 章桂明 4 沈崇尧 1* 严 进 2*
( 1. 中国农业大学农学与生物技术学院 北京 100193 2. 中国检验检疫科学研究院 3. 河北出入境检验检疫局 4. 深圳出入境检验疫局 )