慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达
GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达
GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达姬灿灿;王震英;燕鹏荣;陈楠;吴静;张永飞;宋亚丽;张莉【期刊名称】《中国麻风皮肤病杂志》【年(卷),期】2015(031)001【摘要】目的:明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R 和V37E在HaCaT细胞中的表达.方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达.结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到HaCaT细胞细胞膜上有Cx30蛋白的荧光表达;而V37E突变型荧光表达极弱或无.结论:3种突变体的Cx30表达量不同,初步推测突变体编码的蛋白质或不能定位于角质形成细胞膜或不能形成功能性的Cx30,从而影响了HaCaT细胞正常的增殖和分化.【总页数】4页(P11-14)【作者】姬灿灿;王震英;燕鹏荣;陈楠;吴静;张永飞;宋亚丽;张莉【作者单位】山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021;山东大学附属省立医院皮肤科,济南,250021【正文语种】中文【相关文献】1.网素蛋白1和增强绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体构建和鉴定及在结直肠癌细胞SW480中表达 [J], 何佳;邓峰美;林友胜;刘漪沦2.β-catenin和突变体△N90腺病毒载体的构建及其在MSCs中的表达 [J], 崔恒进;王春燕;胡君;谢桂琴;徐晓静;张焕相3.表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建 [J], 于永生;罗晓彤;吴晓洁;周艳荣;陈红星;邓继先4.IK4基因突变体与其逆转录病毒载体的构建及在白血病细胞中的表达 [J], 史柳芝;郑倩倩;贺立彩;5.IK4基因突变体与其逆转录病毒载体的构建及在白血病细胞中的表达 [J], 史柳芝;郑倩倩;贺立彩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小动物活体成像技术原理及常见问题分析
小动物活体成像技术原理及常见问题分析活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。
通过这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体内肿瘤的生长，转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学过程。
与传统剥瘤称重测量的方法相比，活体成像能够对同一种实验对象在不同时间点进行观察，跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)，数据更加真实可信，成本更低，灵敏度更高。
目前活体成像技术主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧光（Fluorescence）两种技术，生物发光技术是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）标记细胞或是蛋白等研究对象。
其中生物发光技术因其操作简单，反应灵敏，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。
LUC荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。
萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。
萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。
将萤火虫荧光素酶的基因插入慢病毒介导的载体中，通过CAG启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。
常用于细胞标记后小动物细胞移植活体成像追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。
GFP绿色荧光蛋白1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。
将绿色荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过flap-Ub启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。
利用重组慢病毒载体建立稳定表达绿色荧光蛋白细胞系
绿色荧光蛋白——结构及应用
绿色荧光蛋白——结构及应用孙艺佩【摘要】绿色荧光蛋白(GFP)有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点,因此在各个领域已经有了广泛的应用,在细胞生物学与分子生物学领域中,基因常被用作一个报导基因作为生物探针,拿来映证某些假设的实验方法;在医学领域,常用利用绿色荧光蛋白观测肿瘤发生、生长和转移等过程.本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述.【期刊名称】《化工中间体》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】2页(P124-125)【关键词】绿色荧光蛋白(GFP);荧光生色机理;生色团;技术应用【作者】孙艺佩【作者单位】山东省实验中学山东 250000【正文语种】中文【中图分类】Q绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。
1994年，马丁·查尔菲首次在实验中成功表达GFP基因，向人们展示了绿色荧光蛋白作为遗传标签的价值。
同年，钱永健与其同事提出GFP生色团发光机理并改造GFP，使其更易作为标记物应用于各类试验。
2008年，诺贝尔化学奖授予钱永健、马丁·查尔菲和下修村，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白。
这一发现成果为生命科学的进步提供了更便捷的渠道。
从维多利亚多管水母中分离出来的野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。
它具有β-桶的结构，几乎是个直径2.4nm，长4.2nm的完美圆柱。
11个β-折叠链形成β-筒的外周，筒两端分别被一些分子量较小的短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个残基（Ser65-Tyr66-Gly67）与α-螺旋共价相连，位于圆筒中央螺旋中部。
β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入,生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。
稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建
稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建阳小飞;余意;刘孟雪;荣伊;林显光【摘要】为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异.%In order to investigate whether green fluorescent protein (GFP) can stably express with the proliferation of cells in the passage cells, HEK293T cells were infected by the third generation lentivirus to build a cell line stable expressing GFP.The fluorescence intensity and the morphology of the cells were measured by the cell imaging, the current voltage (I-V) curve of HEK293T cells was recorded by whole cell patch.The results showed that GFP could stably express with the proliferation of cells, and the morphology and basic electrophysiological activity were not significantly changed between experimental cells and control cells.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(036)002【总页数】4页(P38-41)【关键词】绿色荧光蛋白;HEK293T细胞;慢病毒【作者】阳小飞;余意;刘孟雪;荣伊;林显光【作者单位】中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院,脑认知国家民委重点实验室,医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室,膜离子通道与药物研发实验室,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q813.6绿色荧光蛋白(GFP)是在水母体内发现的一种荧光蛋白. 经过改造后GFP其结构与光学性质更加稳定，在488 nm的激发光下会发出绿色荧光[1]. 由于其极强的稳定性，在细胞内蛋白的定位、基因表达的监测等实验中发挥了巨大的作用.慢病毒载体是对HIV-1进行改造后得到的慢病毒载体[2,3]，使用慢病毒载体可以有效地将外源shRNA或者基因在宿主细胞内表达[4]. 将慢病毒的几个核心元件(RRE、REV和VSVG)同时转染到体外培养的人胚肾细胞HEK293T中，元件表达后得到的蛋白会互相识别，组装成具有侵染能力的慢病毒[5-7]. HEK293T细胞生物学性质稳定，且表达5型腺病毒E1A蛋白和SV40大T抗原，转染效率高[8-10].选取HEK293T细胞作为宿主细胞. 通过慢病毒侵染的方法将GFP导入HEK293T细胞，侵染后的HEK293T细胞(HEK293T- GFP)在488 nm的激发光下会发出绿色荧光[11]。
ErbB4基因miRNA慢病毒载体的构建及其在小鼠海马齿状回的表达
ErbB4基因miRNA慢病毒载体的构建及其在小鼠海马齿状回的表达李树玲;颜慧;宫泽辉【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》【年(卷),期】2013(027)001【摘要】目的构建靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体,包装产生高滴度慢病毒并观察其感染小鼠海马齿状回基因的表达.方法将靶向ErbB4基因的miRNA干扰质粒利用Gateway重组技术构建慢病毒表达质粒,并与慢病毒包装系统共转染HEK293T包装细胞,收获上清并浓缩得到慢病毒浓缩液,通过测定绿色荧光蛋白(GFP)表达水平测定其滴度.所得慢病毒浓缩液经立体定位微量注射感染小鼠海马齿状回.观察鼠脑冰冻切片基因表达情况,并用神经元标志物神经元核抗原(NeuN)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)特异性抗体行免疫染色分析转导的细胞类型.结果阳性克隆测序结果与设计序列一致,说明靶向ErbB4基因的miRNA慢病毒干扰载体构建成功.包装收获慢病毒.浓缩的慢病毒包装上清感染HEK293T细胞后,流式细胞术检测GFP阳性率,计算得慢病毒活性滴度为1.0×1012转导单位(TU)·L-1.小鼠海马齿状回立体定位微量注射1.0×1012 TU· L-1慢病毒6个月后,观察到注射部位外源基因的显著表达.免疫荧光染色显示,慢病毒转导的细胞多呈NeuN标记阳性,并与GFAP的表达不重叠.结论靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体构建成功,获得了靶向ErbB4基因的高滴度miRNA慢病毒颗粒,并实现了脑实质的局部长期稳定转导,慢病毒转导的主要细胞类型为神经元.%OBJECTIVE To construct a lentiviral vector containing miRNA targeting ErbB4, package high titer lentivirus and observe its infection and expression in thehippocampus dentate gyms of mice. METHODS Lentiviral miRNA vector targeting ErbB4 was constructed from miRNA expression vectors by Gateway recombinant technology. HEK293T producer cell line was contransfected with the lentiviral expression construct and packaging mix, viral supernatant was harvested and condensed, and the titer was determined using green fluorescent protein (GFP) expression with flow cytometry. Lentivirus was stereotactically micro-infused into the hippocampus dentate gyrus of mice. Six months later, brain cryosections were used to observe gene expression. Immunofluorescence staining of brain sections with antibodies specific for neurons marker neuronal nuclei (NeuN) and astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) was used to analyze lentivirus transduced cell types. RESULTS Lentiviral miRNA vector targeting ErbB4 was validated by sequencing, showing the correct construction. Lentivirus were harvest and concentrated after packaging in HEK293T cells. After transduction HEK293T cells with 10 -fold serial dilutions of lentivirus stocks, GFP positive cells were detected by flow cytometry and the lentiviral titer was determined to be 1.0 ×1012 transduction units (TU) ·L-1. Lentivirus mediated expression using GFP as a reporter were observed on hippocampus dentate gyrus in mouse brain sections 6 months after stereotactic micro-infusion lentivirus 1.0 ×1012 TU·L-1. In immunofluorescent staining analysis, most GFP positive cells were labelled for NeuN and no cell was double-labelled for GFP and GFAP. CONCLUSION ErbB4 specific lentiviral miRNA vector is successfully constructed. High titer lentiviral stocks are prepared and transduced braintissue in vivo successfully and stably. Neurons are the primary cell type transduced by lentivirus.【总页数】5页(P29-33)【作者】李树玲;颜慧;宫泽辉【作者单位】军事医学科学院毒物药物研究所新药评价研究室,北京100850;北京军区总医院中心实验科,北京100700;军事医学科学院毒物药物研究所新药评价研究室,北京100850;军事医学科学院毒物药物研究所新药评价研究室,北京100850【正文语种】中文【中图分类】R963【相关文献】1.小鼠SPINK5基因重组过表达腺病毒载体构建及其对特应性皮炎小鼠模型皮损疗效的研究 [J], 狄正鸿;许静;侯殿东;纪莲;刘晓梅;孙鲁宁2.小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达 [J], 孙智慧;韩杰;邵蕾;王利宏;宋俊贤;魏钟海;郑良荣3.小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定 [J], 孙钦儒;贾宁4.基于基因芯片技术研究氯化锂-匹罗卡品致痫小鼠海马组织miRNA-187的表达及GO和KEGG分析 [J], 吴琼;汪顺贵;郭雪峰;李华琼;陈爱玲;刁丽梅;仇小强5.POCD小鼠海马组织中差异表达miRNA的筛选、靶基因预测和生物信息学分析及其调控机制探讨 [J], 张英立;刘乘麟;于明懂;王莹;胡南;卢悦淳;吕国义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠Smad4基因慢病毒表达载体构建及在293T细胞中的表达
１ 哈尔滨医科大学附属第 二医院耳鼻 咽喉头颈外科 （ 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ８ １ ） ２ 中国人民解放军 总医院耳鼻 咽喉头颈外科 解放军 总医院耳鼻喉研究所 （ 北京 １ ０ ０ ８ ５ ３ ）
慢病毒介导的绿色荧光蛋白报告基因对人多能干细胞的生物风险评估研究
工 作 液 、Blebbistatin购 自 安 徽 中 盛 溯 源 生 物 科 技 有 限 公 司 ； 2 m M 谷氨酸盐,0.18 pM p- 巯 基 乙 醇 和 10 mM Y-27632)培养
Matrige丨 购 自 美 国 Coming 公 司 ；Ubi-MCS-EGFP] RES- 8 天 ，形成拟胚体( embryonic body,E B ),将 这 些 E B 铺 到 0.1%
A 通 讯 作 者 ：聂 魏 ，主 要 研 究 方 向 ：干 细 胞 与 组 织 重 建 ，E - m a i l :dr.xinnie@
( 收稿丨J 期 ：2020-丨2 - 2 3 接 受 日 期 :202丨-01-1 8 )
现 物 医 学 Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.12 JUN^021
GFP)报 告 基 因 在 研 究 中 的 应 用 十 分 普 遍 ，且具有其独特的优 势161其 中 慢 病 毒 载 体 由 于 其 整 合 基 因 组 的 特 性 ，其在感染时可 以 有 效 地 将 其 遗 传 物 质 引 入 靶 细 胞 ，可 在 细 胞 或 组 织 中 长 期 稳 定 表 达 目 标 蛋 丨 广 泛 应 用 于 基 W转染m 。但对于慢病毒的安全 性一直存在疑虑，是 否 对 0 标细胞的生物学特性产生不良影响 也较少报道。本 研 究 的 目 的 是 通 过 慢 病 毒 构 建 稳 定 表 达GFP 的 hiPSC,并 验 证 G F P 是否影响细胞的多能性和分化能力。
Green Fluorescence Protein Reporter Gene Labeled Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Lentivirus*
小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定
小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定一、本文概述本文旨在探讨小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定。
我们将详细介绍Zhangfei基因在小鼠体内的功能和作用，以及其在生物学研究中的重要性。
接着，我们将阐述过表达和shRNA干扰技术在基因功能研究中的应用，并解释为何选择慢病毒载体作为本研究的工具。
在构建过表达慢病毒载体方面，我们将采用基因克隆技术将小鼠Zhangfei基因插入慢病毒载体，以实现目的基因的高效表达。
同时，我们将对构建的过表达载体进行严格的鉴定，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。
在构建shRNA干扰慢病毒载体方面，我们将设计并合成针对小鼠Zhangfei基因的特异性shRNA序列，并将其插入慢病毒载体以干扰Zhangfei基因的表达。
我们将对构建的shRNA干扰载体进行同样的鉴定步骤，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。
我们将对构建的过表达和shRNA干扰慢病毒载体进行功能验证，以评估其在小鼠体内对Zhangfei基因表达的调控效果。
本研究的成果将为进一步揭示Zhangfei基因的功能和机制提供有力的工具，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
二、材料与方法2 载体：慢病毒载体pLV-IRES-Puro和pLV-shRNA2购自Clontech 公司。
3 酶和试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR 引物、PCR试剂等购自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS）和DMEM培养基购自Gibco公司；脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠Zhangfei基因的cDNA序列通过PCR从小鼠cDNA文库中扩增得到。
4 仪器：PCR仪、凝胶电泳仪、超净工作台、离心机、细胞培养箱、荧光显微镜、倒置显微镜等。
Eμ-VH 启动子调控 c-Myc 表达慢病毒载体的构建及其体外功能
Eμ-VH 启动子调控 c-Myc 表达慢病毒载体的构建及其体外功能陈琳;陈燕;肖东【摘要】目的：构建人 B 淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH 调控癌基因 c-Myc 表达的慢病毒载体（pEMIR），并探讨其体外功能。
方法以 pLV-c-Myc-IRES-增强绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，经 PCR 扩增、酶切后得到 pEVCHR；以pEVCHR 为模板，PCR 扩增、酶切后得到慢病毒载体 pEMIR，并行测序和酶切鉴定。
将pEMIR 分别瞬时转染入人源胚胎肾细胞293T、人弥漫大 B 细胞淋巴瘤细胞株（OCL-Ly3、OCL-Ly10），倒置荧光显微镜检测各细胞 EGFP 和单体红色荧光蛋白（mRFP）的表达，用 qRT-PCR 法检测细胞内 c-Myc mRNA 表达，用Western blotting 法检测293T 细胞c-Myc 蛋白表达。
结果Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP 基因片段电泳结果与预测值4129 bp 相符，Vector DNA 电泳可见一条带与预测值8561 bp 相符；pEMIR 酶切并电泳的结果与理论预测值相符；对pEMIR 质粒进行测序，结果与预期相符，证明 pEMIR 构建成功。
三种细胞经pEMIR 转染后，倒置荧光显微镜下可见绿色和红色荧光，同时转基因c-Myc表达正常。
结论成功构建Eμ-VH 启动子调控 c-Myc 表达的慢病毒载体，体外实验证明该载体能够在人正常细胞和肿瘤细胞中均可发挥功能。
%Objective To construct a lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of human B lymphocyte-specific Eμ-VH promoter (pEMIR),and to investigate its function.Methods Firstly,taking pLV-c-Myc-IRES-EGFP as a template,after PCR amplification and enzyme digestion,we got pEVCHR.Secondly,taking plasmid pEVCHR as a tem-plate,after PCR amplification and enzyme digestion,we got a lentiviral vector pEMIR.pEMIRwas transiently transfected into human embryonic kidney cells 293T and human diffuse large B-cell lymphoma cell line (OCL-LY3 or OCL-LY10). The expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP)and mono-red fluorescence protein (mRFP)was detected under inverted fluorescence microscope,and the expression of c-Myc mRNA and protein was detected by qRT-PCR and Western blotting.Results The electrophoresis results ofEμ--VH-c-Myc-H2BmRFP gene fragment were in agreement with the predicted value of 4129 bp,and the electrophoresis of the vector DNA showed a band that was consistent with the pre-dicted value of 8561 bp.Enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated that pEMIR was successfully constructed. Cells transiently transfected with pEMIR displayed the green and red fluorescence under inverted fluorescence microscope, and the expression of c-Myc was normal.Conclusion The lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of Eμ-VH promoter is successfully constructed,and the experiments in vitro demonstrate that it can be expressed in human normal cells and tumor cells.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2016(056)021【总页数】3页(P1-3)【关键词】Eμ-VH启动子;c-Myc癌基因;慢病毒载体;弥漫大B细胞淋巴瘤【作者】陈琳;陈燕;肖东【作者单位】南方医科大学，广州 510515;南方医科大学，广州 510515;南方医科大学，广州 510515【正文语种】中文【中图分类】R394目前，用于肿瘤研究的动物模型绝大多数是基于遗传工程的小鼠［1］，极度缺乏人类肿瘤大动物模型。
LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达
细胞 包装 后 ， 收 集 富舍 病 毒 颗 粒 Ｌ Ｖ — Ｌ ＭＰ － １ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ的 细胞 上 清 ， 浓缩并标定滴度 ， Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ检 测 并 鉴 定 。 以 最佳 ＭＯ Ｉ
中国骨伤 ２ ０ １ ３年 １ ０月第 ２ ６卷第 １ ０期 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ｊ Ｏ ￣ ｈ ｏ ｐ Ｔ ｒ ａ ｕ ｍａ ， Ｏ ｃ ｔ ． ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ６ ， Ｎ ｏ ． １ ０
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８ ４１・
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基 础 研 究 ・
Ｌ Ｍ Ｐ 一 １ 基 因慢病毒载体构建及其在大鼠 骨髓 间充质干细胞 的表达
表 达 。结 论 ： 成 功 构 建携 带人 Ｌ ＭＰ － １ 基 因的 慢 病 毒 载 体 ， 可 高效 转 染 大鼠 骨 髓 间充 质 干 细胞 ， 被 转 染 细胞 可 高效 表 达
Ｌ ＭＰ 一１基 因 。
【 关键 词细 胞 ； 骨 质 疏 松
侯 慧铭 ， 向川 ， 郭丽， 张桦 栋
（ 山 西 医科 大 学 第 二 医 院 骨科 ， 山西 太原 ０ ３ ０ ０ ０ １ ）
【 摘要 】 目的 ： 构建人 Ｌ ＭＰ 一 １重组慢 病毒 栽体 ， 体 外转染大鼠骨髓 间充质干细胞 ， 检测 Ｌ ＭＰ 一 １基 因在 大鼠骨髓
间充 质 干 细胞 的表 达 。 方法 ： 利用 Ｐ Ｃ Ｒ 法从 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文 库 中钓 取 Ｌ ＭＰ 一 １基 因 ， 将其与 经 Ａ ｇ ｅ Ｉ 酶 切 线 性 化 的 慢 病毒 载体
NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达_李霏
NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达李霏，李松林，尹元琴（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳１１０００１）摘要目的构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP ）基因的重组慢病毒载体，转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3（HCCLM3），观察其转染效率及表达情况。
方法采用DNA 重组技术，将NK4基因克隆至带EGFP 的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列（IRES ）-EGFP 中，并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLenti6.3-NK4-IRES -EGFP 共转染293T 细胞，包装慢病毒并测定滴度。
以不同感染复数（MOI ）的重组慢病毒感染293T 细胞，筛选最适MOI ，以最适MOI 重组慢病毒感染HCCLM3细胞，观察转染效率。
Western blot 法测定细胞中NK4蛋白表达水平。
结果成功构建共表达NK4基因和EGFP 基因的慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES -EGFP ，并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108TU/mL 。
重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI 为7。
转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达，而未转染细胞中无NK4蛋白的表达。
结论成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体，有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白。
关键词NK4；慢病毒载体；人高侵袭转移肝癌细胞LM3；基因转染中图分类号R73文献标志码A文章编号0258-4646（2011）12-1081-04doiCNKI:21-1227/R.20111226.1615.028网络出版地址/kcms/detail/21.1227.R.20111226.1615.028.htmlConstruction of NK4Recombinant Lentiviral Vector and Its Expression in HCCLM3Cells 肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma ，HCC ）是世界上常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位［1］。
慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展
慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明【摘要】为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础.慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)008【总页数】5页(P116-120)【关键词】转基因;慢病毒载体;载体构建策略【作者】孙克宁;朱化彬;林峰;王栋;郝海生;杜卫华;赵学明【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】S813.3转基因技术使人类根据主观意愿定向改变生物体的性状表型成为可能,而载体种类和质量直接关系到后续转基因的效率,所以表达载体构建成为转基因研究的关键环节之一。
相比较而言,质粒载体、噬菌体DNA载体和人工染色体载体需要借助于昂贵的显微操作仪,并因极低的整合率影响了转基因的效率。
转座子载体虽有较好的应用前景并大量应用于低等动物转基因,但由于受构建哺乳动物高效转座子技术瓶颈的限制,近期内很难在高等动物中取得进展。
慢病毒载体的研究进展及应用
慢病毒载体的研究进展及应用张蕊;龚道清【摘要】慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用.作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)006【总页数】5页(P227-231)【关键词】慢病毒;慢病毒载体;基因治疗;转基因动物【作者】张蕊;龚道清【作者单位】扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae),为RNA病毒,由于这类病毒的一个重要特点是病毒粒子中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶,故现名为逆转录病毒。
慢病毒已经从绵羊(绵羊脱髓鞘性脑白质炎/慢性进行性肺炎病毒)、山羊(羊关节炎脑炎病毒)、牛(牛免疫缺损病毒)、马(马传染性贫血病病毒)、猫(猫免疫缺损病毒)、猴(猴免疫缺陷病毒)和人(人免疫缺陷病毒)中分离得到(Robl等,2007)。
慢病毒在宿主细胞内,能以病毒RNA为模板在自身反转录酶的作用下合成cDNA,再以此cDNA为模板合成双链DNA,经环化后通过病毒整合酶作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达(李跃萍等,2006)。
慢病毒以其基因组为基础去除部分基因代之以所需的目的基因和标记物,构建而成的慢病毒载体(Lentiviral vector)具有转移效率高、可整合入宿主细胞基因组、包装后更安全并可转染非分裂期细胞等优点,在基因治疗和转基因动物生产中得以广泛的使用。
1 慢病毒载体1.1 慢病毒的基本结构慢病毒载体种类很多,其中对HIV-1的结构和生物学特征的研究较多,而HIV-1型已成为目前较为常用的慢病毒载体系统。
慢病毒Tet-On系统调控Notch1-EGFP融合蛋白在PC12细胞中表达的研究
慢病毒Tet-On系统调控Notch1-EGFP融合蛋白在PC12细胞中表达的研究刘永敏;段萍;黄春田;李博;韩雪飞;许燕;鄢文海;邢莹【摘要】目的:构建Tet-On系统调控的人源性Notch1胞内段(NICD)和EGFP融合蛋白的慢病毒真核表达载体,并探讨Notch1-EGFP在PC12细胞中的表达条件.方法:采用RT-PCR从人胎盘组织中获得NICD的cDNA,利用PCR扩增pEGFP-Cl 质粒中EGFP的编码序列,两者均定向克隆到pcDNA3.1(+)质粒中组成Notch1-EGFP片段,将该片段进一步酶切回收,并定向克隆到pLVX-Tight-puro载体获得pLVX-Notch1-EGFP.将构建好的质粒进行病毒包装并感染PC12细胞,抗性筛选2周.在不同时间点和不同浓度Dox作用下,用荧光显微镜观察EGFP表达,流式细胞术检测Notch1表达.结果:酶切和DNA测序均证实pLVX-Notch1-EGFP质粒构建成功.镜下可见感染后的PC12细胞在500 ng/ml Dox诱导36 h时90％以上细胞均表达EGFP.流式细胞术检测Notch1表达结果显示,随着Dox浓度增加,Notch1阳性细胞百分比逐渐增加；随着Dox诱导时间延长,Notch1阳性细胞百分比逐渐增高,到36h时达到最高(81.5％).结论:成功构建携带Notch1-EGFP融合蛋白的Tet-On调控的慢病毒真核表达载体,实现在PC12细胞中调控Notch1-EGFP融合蛋白的表达.【期刊名称】《中国应用生理学杂志》【年(卷),期】2013(029)003【总页数】6页(P232-237)【关键词】Notch1;可诱导的慢病毒;Tet-On系统;PC12细胞【作者】刘永敏;段萍;黄春田;李博;韩雪飞;许燕;鄢文海;邢莹【作者单位】郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;郑州大学病理生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;郑州大学病理生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;郑州大学病理生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;新乡医学院生理学教研室,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】Q28Notch信号是一个在进化过程中高度保守的信号通路，Notch基因在许多组织细胞中都有表达，包括中枢神经系统、胰腺、造血细胞等，它编码一种跨膜受体蛋白，参与调节各种细胞分化及发育的信号转导途径［1-3］。
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选择题下列关于细胞内相关结构的叙述，正确的是A.四种细胞器都具有膜结构，且都能进行能量转换B.葡萄糖进入小肠绒毛上皮细胞中的②彻底氧化分解释放能量C.生物体内的所有激素都在③中合成D.若破坏小鼠浆细胞中的①和③后，免疫水平会发生改变【答案】D【解析】本题是关于细胞结构和功能的题目，各种细胞器中，叶绿体和线粒体与能量转换有关；葡萄糖进入小肠绒毛上皮细胞，是主动运输，需要消耗能量；生物体内激素的种类有很多，有的是蛋白质，有的是脂质，有的是氨基酸的衍生物；浆细胞能产生抗体，抗体是分泌蛋白，加工分泌与内质网、高尔基体、线粒体有关。
A、图中四种细胞器分别是高尔基体、线粒体、内质网和叶绿体，都有膜结构，其中只有叶绿体和线粒体与能量转换有关，A错误；B、葡萄糖进入小肠绒毛上皮细胞是主动运输，需要消耗能量，但是不一定来自线粒体，还可以来自细胞质基质，B错误；C、生物体内的生物体内激素的种类有很多，有的是蛋白质，有的是脂质，有的是氨基酸的衍生物，如果是脂质在③中合成，蛋白质在核糖体上合成，C错误；D、小鼠浆细胞可以合成抗体这种分泌蛋白，分泌蛋白在内质网上的核糖体上合成后，经过内质网和高尔基体的加工后分泌出细胞，因此，破坏图中的①高尔基体和③内质网后，抗体的分泌减少，免疫水平会发生改变，D正确。
故选D。
选择题将与生物学有关的内容依次填入如图各框中，其中包含关系错误的选项是框号选项123456A酶的特性高效性专一性作用条件温和适宜温度适宜PHB细胞增殖无丝分裂减数分裂有丝分裂分裂间期分裂期C稳态的调剂机制神经调节体液调节免疫调节体液免疫细胞免疫D目的基因的获取PCR技术人工合成基因文库基因组文库部分基因组文库A.AB.BC.CD.D【答案】C【解析】本题是关于概念图的问题，生物概念有许多包含关系，酶的特性包括高效性、专一性和作用条件温和的特点，条件温和包括适宜的温度和适宜的PH；真核细胞的增殖包括无丝分裂、减数分裂和有丝分裂，而有丝分裂过程包括分裂间期和分裂期；人体和高等动物体目前公认的稳态调节机制是神经-体液-免疫调节机制，而免疫调节中包括了非特异性免疫和特异性免疫；基因工程中目的基因的获取方法包括PCR 技术，人工合成，基因文库包括基因组文库和部分基因组文库。
下调CD36在心肌中的表达对肥胖小鼠心肌纤维化和凋亡的影响
下调CD36在心肌中的表达对肥胖小鼠心肌纤维化和凋亡的影响陶静; 钱润芳; 陈俊婷; 周佳莉; 夏巍; 张逸杰【期刊名称】《《医学研究杂志》》【年(卷),期】2019(048)009【总页数】6页(P25-30)【关键词】肥胖模型; CD36; 心肌纤维化; 凋亡【作者】陶静; 钱润芳; 陈俊婷; 周佳莉; 夏巍; 张逸杰【作者单位】430060 武汉大学人民医院心内科、武汉大学心血管病研究所、心血管病湖北省重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R541.8肥胖是一种慢性代谢性疾病，主要表现为体脂含量的增加，其发生率在全球均呈上升趋势。
临床上通常将体重指数>30kg/m2定义为肥胖。
世界卫生组织(WHO)的调查报告显示，当前全球约有5亿肥胖症患者[1]。
该疾病已超越营养不良，成为全球成年人最大的慢性健康问题[2]。
虽然我国肥胖的发生率低于美国、英国等发达国家，但由于人口基数大，患病人群的绝对数量仅次于美国，居世界第2位[3]。
病理性肥胖是导致劳力丧失和死亡的主要原因之一，不仅影响到成人，而且影响到儿童和青少年[2]。
肥胖与心血管疾病的发生密切相关，是高血压、冠心病、2型糖尿病等疾病的高风险因素，其患病人群多合并高脂血症、胰岛素抵抗等代谢紊乱，可引起不同器官的病理改变[4～6]。
即使排除其他心血管病危险因素，肥胖患者心肌也可出现广泛病变而导致心脏重构，表现为从舒张性心力衰竭(以下简称心衰)到收缩性心衰的演变[7]。
心肌细胞在生理状态时主要通过脂肪酸(fatty acids, FA)的β氧化及葡萄糖的有氧氧化供能。
肥胖或糖尿病时，机体发生胰岛素抵抗，心肌细胞对葡萄糖的利用率降低，更加依赖FA的β氧化供能，对FA的转运及利用效率均提升[8]。
这种能量代谢谱的改变使得心肌内有害脂质蓄积、代谢副产物生成增多，通过脂毒性效应及氧化应激损伤，介导心肌纤维化、心肌细胞凋亡及钙调控异常等一系列病理改变，最终导致肥胖性心肌病[9～11]。
慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究
慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究摘要】目的探讨以慢病毒（Lentivirus, LV）为载体，转染绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）基因至神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的方法，观察其转染效率。
方法应用包装细胞293T将三种质粒载体pGC-E1-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0经脂质体转染重组，构建成表达GFP的慢病毒载体（Lentiviral vector-GFP,LV-GFP）。
并从孕14天大鼠胚胎的脑组织分离出神经干细胞，采用无血清培养法，进行体外培养、扩增。
取经过5次传代神经干细胞，以1×105个细胞/500μl/孔接种于24孔板，分别按复感染指数（Multiplicities of infection,MOIs值）为0、1、5、10、15、20加入LV-GFP稀释液100μl,每一滴度加六孔,共六组。
48～72小时后于倒置荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率，并在72小时后进行神经干细胞球进行计数，以观LV-GFP对NSCs增殖的影响。
并行流式细胞仪检测，得出各组NSCs的 GFP阳性转染率。
结果除MOI值为0的对照组外，48～72小时后各孔均有GFP表达。
MOI值从0增至10，细胞的阳性表达率逐渐提高(P<0.05)，MOI值为10的组能获得>90%的转染率。
但MOI值从10增至20，形成的神经干细胞球数目却逐渐减少(P<0.05)。
结论 LV是将目的基因转入NSCs的理想载体。
以MOI为10的滴度，LV可将GFP基因高效转入神经干细胞内并表达。
【关键词】神经干细胞慢病毒载体转基因绿色荧光蛋白中枢神经系统的常见疾病如Parkinson,s病、中风、多发性硬化及脊髓损伤等主要由神经元和神经胶质细胞结构和功能的缺失引起，应用干细胞移植技术来治疗上述疾病的基础研究已取得一定进展。
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慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达
【摘要】本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统，并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。
应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道元件、泛醌启动子和绿色荧光蛋白基因连接至pLO134载体，构建成pTK153载体。
之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统共转染293T细胞，12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞，在荧光显微镜下和应用流式细胞仪观察感染情况。
结果表明：慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，FACS分析转染效率为%，病毒滴度测定为
×106 U/ml。
感染小鼠T淋巴细胞后，荧光显微镜下观察到GFP的表达，FACS分析转导效率为%。
结论：成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体，对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。
【关键词】慢病毒载体 T淋巴细胞绿色荧光蛋白基因
Expression of Green Fluorescent Protein Gene in Mouse T Lymphocytes Mediated by Lentiviral Vector
Abstract This study was purposed to
the lentiviral vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene and to investigate the expression of GFP in T lymphocytes of the mouse. The polypurine tract (PPT) element, ubiquinone promoter (PUB) and GFP were ligated to plasmid pLO134 using subcloning technology to construct plasmid pTK153. Human kideny 293T cells were
system containing packaging plasmid
△NRF, plasmid pTK153 and envelope
calcium phosphate DNA precipation and the expression of GFP was observed under
fluorescence microscope after 12 hours. The viral particles were collected after transfection 72 hours, were frozen at -80℃ and were used to infect mouse T lymphocytes at multiplicity of infection ( .) of 3. The expression of GFP in mouse T lymphocytes was observed by fluorescence microscopy and
(FACS). The results showed that the transfection efficacy was ±% in 293T cells analysed by FACS and the viral titer was (±)×106 U/ml. The expression of GFP was also evident in mouse T lymphocytes and the transduction efficacy was (±)%. It is concluded that
vector containing GFP gene is successfully constructed and the transduction efficacy is high in mouse T lymphocytes.
Key words lentiviral vector; mouse T
lymphocytes; green fluorescent protein gene
J Exp Hematol 2007; 15(1):125-128
逆转录病毒载体系统已被广泛应用于临床前及临床的基因转移研究，虽然对其复制以及转导外源目的基因至细胞的相关机理研
究得较为深入，但是逆转录病毒载体不能有效转导非分裂期细胞，因而其应用于临床基因治疗受到了一定的限制［1］。
围绕这一问题，近年来人们把目光投向了来源于包括人类免疫缺陷病毒在内的慢病毒载体。
LV 最大的特点是可以感染非分裂期细胞如神
经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞等［2］。
我们构建了以为基础的LV三质粒系统，并以绿色荧光蛋白基因作为标志基因，观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。
LV三质粒系统的构建及鉴定
用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ分别从pTK131、pTK145及pTK54切下PPT元件、PUB 启动子及GFP基因，用T4DNA连接酶依次将PPT元件、PUB启动子及GFP基因连接至由
BamHⅠ酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去除
的载体pLO134上，连接产物转化感受态细胞DH5α，同时设立空白对照。
37℃过夜培养，次日从连接板挑取6-8个克隆进行扩增培养，用Promega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒后，分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SacⅡ和AgeⅠ+XbaⅠ鉴定连接产物的正反向。
包装质粒△NRF、包膜蛋白质粒、pTK131、pTK145及pTK54均为本科徐开林教授构建。
慢病毒载体包装细胞系的建立
应用Ivitrogen 公司无内毒素的质粒中量提取试剂盒提取pTK153、△NRF及
用于转染。
转染前24小时选择生长状态良好的293T细胞按1∶3传代，24小时后细胞生长达60%-70%汇合时采用磷酸钙沉淀法进行转染。
将转移质粒pTK153 15 μg、ΔNRF 10 μg、μg、CaCl2 125 μl，补加消毒的双蒸水至500 μl，在涡旋混合器上边振荡边加入500 μl 2×BES，室温放置30分钟。
将转染液加到培养板中，轻轻混匀，3% CO2、37℃培养箱中培养3小时后，。