流式细胞术

与光学系统、信号收集与信号转换 系统、计算机与分析系统
STUMC
2014.10.13
流动室与液流系统
• 流动室由石英玻璃制成，并 在石英玻璃中央开一个孔， 供细胞单个流过，检测区在 该孔的中心，流动室内充满 了鞘液,鞘液的作用是将样品 流环包。 • 样品流在鞘流的环包下形成 聚焦，保证每个细胞通过激 光照射区的时间相等，从而 得到准确的细胞荧光信息。
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2014.10.13
细胞分选原理
• 当某类细胞的特性与要分 选的细胞相同时，流式细 胞仪就会在这类细胞形成 液滴时给含有这类细胞的 液滴充以特定的电荷，带 有电荷的液滴向下落入偏 转板间的静电场时，依所 带电荷的符号分别向左偏 转或向右偏转，落入指定 的收集器内。
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三 流式细胞术的重要术语
• 前向散射与侧向散射
• 散射光信号 细胞在鞘液流中通过激光照射-测量区，细 胞向空间呈360°立体角方向散射光线，散射信号与细胞 大小、形状、质膜以及细胞内颗粒结构的折射率有关。 • （1）前向散射(forward scatter FSC) 也称小角度散射 ，该值的大小与细胞的直径成近似直线关系，对于不同的 细胞，细胞越大，其FSC越大;反之则越小 • （2）侧向散射（side scatter SSC） 又称90°散射，它 对于细胞膜、胞质和核膜的折射更为敏感，其散射强度几 乎与细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系，即细胞内颗 粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大;反之则越小
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三、流式细胞仪在肿瘤学中的应用
近年来荧光细胞化学技术的发展，以 及荧光探针标记的单克隆抗体，为流式细 胞技术研究各种肿瘤抗原、肿瘤蛋白、致 癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤 学的研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤 学的研究中开辟了更广阔的应用前景。
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• 2.衰减 • （2）光学系统：若干组透镜、滤光片和分 光镜等光学元件组成，将不同波长的光信 号送入到不同的探测器 • 滤光片： 1.长通滤光片 2.短通滤光片 3.带
通滤光片 4.二分镜
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信号收集与光电转换系统
（光电转换器件、放大器和信号处理电路）
• 流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般 流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。
狭缝扫描流式细胞仪
被检细胞直径大于激光 光斑直径，细胞通过光 束时各部分被依次扫描， 可计算出细胞直径大小、 核直径大小、核浆比例 等一系列的形态学信息 的定量资料。
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流式细胞仪基本结构
• 四大模块：流动室与液流系统、光源
• 5 分选特定性状或功能的细胞
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二 流式细胞仪分类与基本结构
• 流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和 科研型。 • 临床型只有分析功能，没有分选功能，操 作简便，易学易掌握。 • 科研型既有分析功能又有分选功能，可快 速将所感兴趣的细胞分选出来。
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Leabharlann Baidu
荧光信号及其面积与宽度
1.荧光信号脉冲高度表示荧光 信号的强度，表示为FLnHeight 2.荧光信号脉冲面积（FLn-A） 是采用积分计算的荧光通量， 一般对DNA倍体分析时采用面 积与宽度，其他分析则一般采 用脉冲高度 3.荧光信号脉冲宽度（FLn-W ）反应荧光的分布，常用来区 分双连体细胞。
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四 流式细胞仪的临床应用
• 一、流式细胞仪在免疫学中的应用
• 流式细胞术广泛地应用于免疫理论研
• 究及其临床实践，尤其同单克隆抗体的结
• 合应用，在淋巴细胞及其亚群分析、淋巴 • 细胞功能分析、免疫分型、分选、肿瘤细 • 胞的免疫检测、研究细胞周期等方面都起 • 着相当重要的作用
汕头大学医学院第二附属医院
The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College
流式细胞术
基本原理与实用技术
汕大2013级马杰
STUMC 2014.10.11
唇腭裂治疗中心
一 流式细胞术基本原理
• 流式细胞术的定义:应用流式细胞仪对处于
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光源与光学系统
• 流式细胞仪的检测是基于对光信号（散射 光和荧光）的检测来实现的，光源与光学 系统由激发光源、一系列光通过和光反射 的镜片组成
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2014.10.13
• （1）激发光源：弧光灯和激光器 • 特点：1.单色性和单向性 单色性是指一种激光
往往为某一波长的光；单向性是指激光的方向性相当好， 几乎没有侧散射并且能进行远距离传播 488nm 633nm
快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行逐个、 多参数、快速的定性、定量分析和分选的技术。
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流式细胞术的特点
• 1 实现对单列细胞或生物颗粒进行逐个检测 只要是标
本是单个细胞或生物颗粒，即可用于分析（血液、骨髓、体液中的细胞、培 养细胞等），实体组织经过处理后制成的单细胞悬液也能分析
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2014.10.13
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二、流式细胞仪在细胞生物学中的应用
细胞生物学研究中，应用最频繁也最普通 的是细胞周期分析，研究细胞周期或DNA倍体 与细胞表面受体及抗原表达的关系，包括细 胞周期各时相的百分比和细胞周期动力学参 数的测定等内容。对同一细胞的参数测定技 术则导致了对细胞周期的一些新发现
计算机与分析系统
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生物学颗粒分析原理
• 将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色 后，放入样品管。在气体压力的作用下，单细胞 悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室， 沿流动室的轴心向下流动。 • 流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕 细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组 成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平 方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。
• 2 实现高通量检测 流式细胞仪可以每秒数十、数百、数千个细胞的
速率进行检测
• 3 多参数、多色荧光分析对细胞特性的识别、计 数更为准确 用不同荧光素标记的单克隆抗体进行多色荧光染色，可同
时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征
• 4 定性或定量分析细胞 通过荧光染色对单个细胞或生物颗粒的某
些成分，如DNA含量、抗原或受体表达量、 Ca2+浓度、酶活性、细胞的功能 等均可进行单细胞水平的定性与定量分析
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光谱重叠与荧光补偿
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2014.10.13
• 流式细胞仪在设计时加入了电子补偿系统，去除 因光谱重叠而进入其他荧光探测器的荧光信号， 这个过程叫荧光补偿。补偿的程度一般要根据当 时仪器状态与各荧光脉冲强度来决定。 • 荧光补偿分人工补偿与自动补偿（数字信号处理 器DSP）
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2014.10.13
• 染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同 时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光 电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这 些数字化信息，就可以定性、定量分析细胞膜、 细胞质和细胞核中的各种细胞成分，而且还可以 研究细胞的各种功能状态（如细胞增殖、细胞凋 亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、氧化还 原状态、吞噬性等）。目前通过液相芯片技术还 可以定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分 。