酶ppt课件 (2)

1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋 白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA 可催化E. coli tRNA的前体加工。
Sidney Altman Yale University New
Haven, CT, USA
Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催 化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶）， 2人共同获1989年诺贝尔化学奖。
1．全部操作在低温0～4℃。
2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、
少量β-巯基乙醇。 4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓
度，从而求得比活力，还要计算总活力。
步骤 (NH4)2SO4
沉淀 乙醇沉淀
酶活力 蛋白质浓度 比活力 总活力
酶活力 比活力＝
OH
O
OH邻 苯 二 酚 氧 化 酶
O
2
+ O2
2
+ 2H2O
邻苯二酚
邻苯醌
（2）脱氢酶类：直接催化底物脱氢
A·2H + B
A + B·2H
例：乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）
COOH
COOH
乳 酸 脱 氢 酶
H O C H+N A D +
CO +N A D H+H +
（三）酶的化学本质
1．大多数酶是蛋白质（Most enzymes are proteins）
1926年美国Sumner 脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白 酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。
J.B.Sumner
J.H.Northrop
（一）命名
1．系统名称（systematic name） （1）标明底物，催化反应的性质
例: G-6-P→F-6-P G-6-P异构酶
（2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:） 分开。如其中一个底物为水时，水可略去。
例1： 丙氨酸+α-酮戊二酸 → 谷氨酸+丙酮酸
丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶
1986年美国Schultz和Lerner两个实验室同时在Science上发 表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。
抗体酶的性质 抗体酶的用途
4．有些DNA也有催化活性
1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具 有催化活性。
（四）酶的组成
1．单纯蛋白质酶类 2．缀合蛋白质酶类
全酶=酶蛋白+辅助因子（辅酶、辅基或金属离子） 辅酶（coenzyme） 辅基（prosthetic group）
比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用 U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。
比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）
比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示。
（3）转换数（TN or kcat)
在最适底物浓度时，每分钟或每秒钟每分子酶 转换底物的分子数。
（4）分子活性（molecular activity）
有离子选择性电极法、微电子电位法、电流法等。
离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有 离子浓度的变化或气体的变化（如O2、CO2、NH3 等）。
例: 葡萄糖氧化酶活性的测定 葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖氧化酶 葡糖酸+H2O2
四、酶的作用动力学（kinetics）
什么是动力学？ 什么是酶作用动力学？
例：
乙 酸 + C o A － S H + A T P 乙 酰 － S － C o A + A M P + P P i
（水解） （裂合）
（异构） （连接酶）
三、酶的分离、提纯及活力测定
（一）酶的分离提纯
1．选材 2．破碎细胞 3．抽提 4．去核酸、去多糖 5．提纯 6．保存
由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 :
酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅 基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。
例：乙醇 + NAD+ 乙醇脱氢酶 乙醛 + NADH + H+
（3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay)
第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个 酶系统在一起反应。
1．Cell vol 31, 147～157，1982年。
2．Sci. Amer. Vol 255, 64～75，1986。
3．抗体酶（abzyme）
抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。 抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区
（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区 域被赋予了酶的属性。
（一）底物浓度对酶反应速度的影响
1．米氏方程的提出
中间复合物学说：
第一步: E+S
ES
第二步: ES→E+P
V∝[ES]
1913年Michaelis和 Menten推导了米氏方程
v Vmax[S] Km [S]
2．米氏方程的推导
基本前提：
中间复合物学说: E+S
ES→E+P V∝[ES]
（五）根据酶蛋白分子的特点将酶分成三类
1．单体酶（monomeric enzyme） 2．寡聚酶（oligomeric enzyme） 3．多酶复合物（multienzyme complex）
二、酶的命名和分类
1961年国际酶学委员会（enzyme commission）提 出的酶的命名和分类方法。
EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC l.1.1.1 Enzyme Handbook， Thomas E Barman编，Vol I, Vol II 1969年。 Enzyme Handbook，Thomas E. Barman编 Supplement I, 1974年。
（三）六大类酶催化反应的性质
例2： 脂肪+H2O → 脂酸+甘油
脂肪水解酶
2．习惯名称（recommended name）
（1）底物 （2）反应性质 （3）底物，反应性质 （4）来源或其它特点
（二）系统分类法及编号
1．分类:
6大类酶，氧转水 裂异连
2．编号:
用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“·”隔 开，前面冠以EC（为Enzyme Commission）。
1．氧化还原酶类（oxido-reductases）
催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、 脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。
（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O或H2O2 。
2A·2H+O2 A·2H+O2
2A+2H2O A+H2O2
例： 邻苯二酚氧化酶（EC 1.10.3.1，邻苯二酚：氧氧化酶）
蛋白质浓度 总活力＝单位体积的酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml)
（二）酶活力的测定
酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） 酶活力的测定
1．测定酶活力时应注意几点
（1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed）
（2）酶的反应速度一般用单位时间
酶
主要介绍酶的化学本质、结构和特性；酶的作 用动力学；酶的作用机理；酶的应用；还介绍 了别构酶、共价调节酶、同工酶等的概念、性 质、生物学意义。
一、酶的概念
（一）酶的生物学意义
6CO2+6H2O+能量
植物
动物 C6H12O6+6O2↑
N2 + 3H2 某些微生物 2NH3
N2+3H2 500℃ ,300大气压
Fe
2NH3
（二）酶是生物催化剂
1．酶与一般催化剂的共同点
（1）用量少而催化效率高
（2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反 应前后本身不发生变化
如 CO2+H2O
H2CO3
（3）降低反应所需的活化能
例 2H2O2→2H2O+O2
反应 非催化反应 钯催化反应 H2O2酶催化
活化能 75.24kJ/mol 48.9kJ/mol 8.36kJ/mol
产 物
内产物的增加量来表示。
浓
度
[P]
（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子
强度和底物浓度等因素保持恒定。
（4）测定酶反应速度时，应使[S]>>[E]。
(t)
2．酶活力和比活力表示方式
（1）酶活力（enzyme activity）
酶பைடு நூலகம்力的定义
酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U）
简便、迅速、准确。
一个样品可多次测定，有利于动力学研究。 可检测到10-9mol/L水平的变化。
例: 人血清乳酸脱氢酶活力的测定
乳酸脱氢酶
L-乳酸 + NAD+
丙酮酸 + NADH + H+
（2）荧光法（fluorometry）
该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。
反应方程式:
k1
k3
E+S ES E+P
k2
k4
在米氏方程推导中引入3个假设:
（1）P→0 忽略 E+Pk4 ES这步反应
E + S E S E + P
（2）∵ [S]>>[E]
∴[S] － [ES]≈[S]
（3）E+S
ES平衡，要求k3<<k2 。
平衡法推导：
推导的要点
推导方法
结果:
v Vmax[S] KS [S]
酶单位的定义
1961年国际酶单位（IU） 1972年Katal（简称Kat）单位
习惯上沿用的单位如 :
乳酸脱氢酶
乳酸 + NAD+
丙酮酸 + NADH + H+
乳酸脱氢酶的活力可用丙酮酸的增加量表示，也 可用340nm光吸收的增加量来表示。
（2）酶的比活力（specific activity，也称比活性）
S E 1 P 1 E 2 P 2
P1无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有光 吸收或荧光变化。
例：测己糖激酶的活性
葡萄糖 + ATP 己糖激酶 葡糖-6-磷酸 + ADP 葡糖-6-磷酸 + NADP G-6-P脱氢酶 葡糖酸-6-磷酸 + NADPH + H+
（4）电化学法（electrochemical method）
结果:
v Vmax[S] Km [S]
3．米氏方程的讨论
（1）米氏方程与一级反应和零级反应 （2）Vmax与酶的转换数 （3）酶被底物饱和的百分数
fE S[ [E tE ] k k S 3 3 [ [E tE ] ] V S v ma ]x K m [ S [S ] ]
20世纪80年代发现某些RNA有催化活性， 还有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA 也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受 到很大冲击。
2．某些RNA有催化活性
1982年美国T. Cech等人发现四膜虫的rRNA前体 能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现 RNA有催化活性
Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA
恒态法推导：
1925年Briggs和Haldame对米氏方程作了一次重要 的修正，提出了恒态的概念。
k1
k3
E+S ES E+P
k2
所谓恒态是指反应进行一定 时间后，ES的生成速度和ES的分 解速度相等，亦即ES的净生成速 度为零，此时ES的浓度不再改变， 达到恒态，也称稳态。
恒态法推导要点
推导方法
AB
A+B
例1：
例2：
5．异构酶类（isomerase）
催化异构化反应
A
B
例：
6．连接酶类（ligases, 也称synthetases合成酶类）
将两个小分子合成一个大分子，通常需要ATP供能。 A + B + A T P A B + A D P + P i A + B + A T P A B + A M P + P P i
2．酶作为生物催化剂的特殊点 （1）高的催化效率
以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催 化剂高107～1013倍，比非催化反应高108～1020倍。 例 2H2O2→2H2O+O2 1mole H2O2酶 能催化 5×106mole H2O2的分解
1mole Fe3+ 只能催化6×10-4mole H2O2的分解
C3H
乳酸
C3H
丙酮酸
2．转移酶类（transferases）
催化基团的转移
AR + B
A +BR
例：谷丙转氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸： α—酮戊二酸氨基转移酶）
3．水解酶类（hydrolases）
AB + H2O
A·OH + BH
4．裂合酶类（lyases）
从底物移去一个基团而形成双键或逆反应
在最适底物浓度时，每分钟每分子酶转换底物 的分子数。
（5）催化中心活性（catalytic center activity）
每分钟每一个催化中心所转换底物的分子数。
3. 酶活力的测定方法
（1）分光光度法（spectrophotometry）
该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分 光吸收不同。
优点：