聚合酶链式反应原理
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
q-pcr原理
q-pcr原理
qPCR（定量聚合酶链式反应）是一种基于PCR原理的技术，可以高度灵敏地检测和扩增DNA分子。
qPCR可以量化起始DNA模板的数量，因此也称为实时PCR（RT-PCR）。
qPCR原理基于利用DNA聚合酶酶的活性和荧光探针的高特异性。
在qPCR反应中，DNA聚合酶酶通过PCR扩增DNA的特定序列，在反应过程中荧光探针结合到扩增的DNA序列上，并通过激发荧光产生荧光信号。
qPCR反应过程中荧光信号的增加量与PCR产物（即扩增的DNA序列）的数量成正比。
因此，量化荧光信号可以确定PCR产物的数量，从而对起始DNA模板的数量进行定量分析。
qPCR常用于基因表达分析，DNA测序、病原体检测等领域。
聚合酶链式反应PCR基本原理
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是防止3′ 端旳互补重叠。
• ⑤引物与非特异扩增序列旳同源性<70%。
• ⑥引物旳3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做某些修饰。
• 2、PCR旳模板
• 欲扩增旳核酸片段是PCR旳模板。
• 能够是DNA，也能够是RNA。当用RNA作模板时， 首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正 常旳PCR循环。
3、耐热旳DNA聚合酶
• 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键旳原因 之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广 泛旳耐热DNA聚合酶。
• TaqDNA聚合酶旳功能是：以DNA为模板，以 四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点， 按5′→3′旳方向，以碱基配对方式合成 新旳DNA链。
寡核苷酸。
• 引物决定PCR扩增产物旳特异性和长度。 • PCR引物旳设计与PCR反应旳成败关系亲密。 • PCR反应中旳引物有两条，即5′端引物和3′
端引物，分别与相应旳模板链互补。
• 引物设计遵照下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基旳分布尽量随机，尽量防止多聚 嘌呤或多聚嘧啶。
二、PCR旳基本原理
• PCR技术实际上是DNA旳体外扩增技术。 • 其原理类似于DNA在体内旳复制过程。 • 反应条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA
聚合酶、四种dNTP原料和合适旳缓冲液体系， 在一定旳温度下，经过反复旳过程，就能够 完毕DNA旳体外合成。
• 这些过程都是经过控制温度来实现旳，即经 过 变 化 温 度 引 起 变 性 （ denature ） 、 退 火 （ annealing ） 和 延 伸 （ extension ） ， 使 DNA得以复制。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用QPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）即定量聚合酶链式反应，是一种可以对DNA进行定量检测的分子生物学技术。
通过测定DNA模版的初始数量，能够准确地对靶DNA在样品中的量进行定量分析。
QPCR技术已经广泛应用于医学、农业、环境科学等众多领域，并且在疾病诊断、基因表达研究、生物安全监测等方面具有重要意义。
QPCR的原理：QPCR主要基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理。
PCR技术通过DNA聚合酶，利用DNA引物和酶切的DNA模板来扩增特定DNA序列。
在PCR的每一个循环中，DNA模板会被酶切成两段，然后引物结合到目标DNA上并扩增。
然后，扩增的DNA产物作为下一个PCR循环的模板，以此循环反复扩增。
在QPCR中，扩增的DNA产物通过酶的同步检测来实时监测。
QPCR使用一种荧光探针，在引物结合区域的扩增过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增DNA的数量呈正比。
通过检测荧光信号的强度，可以确定DNA的初始数量。
QPCR的应用：1.疾病诊断：QPCR可以快速、准确地检测疾病相关基因的表达水平，从而帮助进行疾病的早期诊断和病情监测。
比如，QPCR可以检测癌症相关基因的表达水平，辅助肿瘤的早期诊断和治疗。
2.基因表达研究：QPCR能够定量检测基因的表达水平，从而帮助研究基因在细胞和组织中的功能调控机制。
比如，研究在药物处理、细胞因子刺激等条件下，特定基因的表达水平的变化。
3.遗传病筛查：QPCR可以对遗传病相关基因进行定量检测，从而帮助进行遗传病的筛查。
通过检测特定基因的突变和表达水平，可以早期发现遗传病，并进行相应的干预和治疗。
4.放射性污染监测：QPCR可以快速、敏感地检测放射性物质污染的程度和范围。
比如，监测环境中的放射性同位素污染，以保护公众健康。
5.植物基因改良：QPCR可以帮助筛选目标基因在转基因植物中的表达水平。
通过检测基因的表达水平，可以确定转基因植物是否具有目标特性，从而加速植物基因改良的进程。
荧光pcr技术的基本原理和过程
荧光PCR（聚合酶链式反应）技术的基本原理是利用高温变性、低温退火和中温延伸三个基本反应步骤来扩增特定的DNA片段。
在每个循环中，DNA模板首先在高温下变性成为单链，然后在低温下与引物结合，最后在适温下通过酶的作用延伸合成新的DNA链。
通过多次循环，DNA含量可以大量扩增。
荧光PCR的过程包括以下步骤：
1. **DNA的变性**：将DNA样品加热至95℃左右一定时间后，使DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。
2. **低温退火**：将DNA温度降至55℃左右，引物与DNA单链的互补序列配对结合。
3. **中温延伸**：在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
此外，荧光PCR技术中还包括荧光探针结合的过程。
引物结合的同时，荧光探针也会与目标DNA序列结合。
荧光探针通常由一个荧光染料和一个阻尼染料组成。
在荧光探针与目标DNA序列结合后，两个染料之间的荧光共振能量转移会发生，从而使荧光信号发生变化。
这一过程使得研究人员可以通过检测荧光信号来监测DNA的扩增情况。
以上内容仅供参考，如需更全面准确的信息，建议查阅荧光PCR 技术的相关文献或咨询该技术领域的专家。
简述PCR的基本原理和步骤及步骤要点
简述PCR的基本原理和步骤及步骤要点PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它能够快速而准确地扩增DNA片段。
本文将对PCR的基本原理、步骤以及步骤要点进行简述。
基本原理PCR基于DNA的复制原理，通过不断重复三个基本步骤（变性、退火和延伸）来扩增特定DNA片段。
具体而言，PCR需要以下三种主要成分：DNA模板、引物和聚合酶。
1.DNA模板：PCR需要从中复制目标DNA片段的DNA模板。
该DNA可以是从细胞中提取的总DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
2.引物：引物是两个短的DNA片段，其中一个与目标DNA片段的起始位置互补，另一个与目标DNA片段的末端互补。
引物的作用是提供了PCR反应的起始点。
3.聚合酶：聚合酶是PCR反应中的关键组分，它能够在退火温度下从引物的起始点开始，沿着DNA模板链合成新的DNA链。
PCR的基本原理是通过不断重复以下三个步骤来扩增目标DNA片段。
步骤及步骤要点1.变性：在PCR反应的第一步，反应混合液中的DNA模板被加热到高温（通常为94-98℃），使DNA双链解开成两条单链（变性）。
•高温变性有助于断开DNA双链的氢键，使之成为两条单链。
2.退火：在PCR反应的第二步，反应混合液被冷却到较低的温度（通常为50-65℃），使引物与目标DNA片段互补结合。
•引物与目标DNA片段的互补配对使得引物能够定位在目标DNA片段的特定位置。
3.延伸：在PCR反应的第三步，反应混合液被加热到适合聚合酶活性的温度（通常为72℃），使聚合酶从引物的起始点开始合成新的DNA链。
聚合酶能够识别引物，在引物的3’端添加互补的核苷酸，从而合成新的DNA 链。
这三个步骤组成了一次循环，形成一个PCR循环。
每个PCR循环都会使目标DNA 片段的数量成倍增加。
通常，进行20-35个PCR循环，即可扩增到足够的DNA量以进行后续分析。
需要注意的是，PCR反应需要针对具体的目标DNA片段选择合适的引物，在设定的PCR温度条件下进行。
聚合酶链式反应的原理
聚合酶链式反应的原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，其原理是通过体外扩增DNA片段，从而获得足够数量的特定DNA序列。
PCR技术的发明极大地推动了分子生物学和遗传学研究的发展，它成为了现代生物学研究中不可或缺的工具。
PCR技术的原理非常简单，它主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，将待扩增的DNA样本加热至95摄氏度，使双链DNA 变性成两个单链。
接着，将温度降低至50-65摄氏度，引入引物（即PCR反应中的两个端点）与单链DNA互相结合，使引物能够特异性地与待扩增的DNA片段结合。
最后，将温度升高至72摄氏度，加入DNA聚合酶酶解体，开始延伸新的DNA链。
这样，经过多个循环，就可以在短时间内扩增出大量目标DNA。
PCR技术之所以能够高效地扩增DNA片段，是因为它利用了DNA 聚合酶的特殊性质。
DNA聚合酶是一种具有高度稳定性和高度特异性的酶，它能够在适宜的温度下，通过模板引导合成新的DNA链。
在PCR反应中，DNA聚合酶扮演着关键的角色，它能够识别引物与单链DNA的结合部位，并在引物的引导下合成新的DNA链。
通过不断循环变性、退火和延伸的步骤，PCR技术可以在短时间内扩增出数百万数量级的目标DNA片段。
PCR技术的应用非常广泛，尤其在基因检测、疾病诊断和法医学鉴定等领域具有重要意义。
例如，在基因检测中，PCR技术可以用于检测某些基因的突变，从而帮助科学家了解某种遗传疾病的发病机制。
在疾病诊断中，PCR技术可以通过检测特定病原体的DNA片段，快速确定病情，提高诊断的准确性。
在法医学鉴定中，PCR技术可以通过检测受害者和嫌疑人的DNA，快速确定是否存在亲缘关系，为司法鉴定提供科学依据。
除了在实验室中的应用，PCR技术还有许多其他的衍生技术。
例如，实时荧光PCR技术可以实时监测PCR反应的进程，通过荧光信号的强度变化来定量检测目标DNA的含量。
PCR(聚合酶链式反应)原理
PCR(聚合酶链式反应)原理PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在T aq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。
这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。
如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。
而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。
到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。
这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。
PCR 的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI 诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。
dna聚合酶链式反应的原理
dna聚合酶链式反应的原理DNA聚合酶链式反应：从原理到应用DNA聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种用来扩增DNA分子的技术。
PCR技术的出现，让繁琐的DNA扩增工作变得简单快捷，从而推动了分子生物学、医学等领域的迅速发展。
PCR原理简介PCR技术的基础是DNA的双链结构，以及DNA聚合酶的作用。
PCR分为三步：变性、退火和延伸。
变性：将待扩增的DNA样品加热至90-95℃，使其双链分离成两条单链，即变性。
退火：降温至50-60℃，加入PCR引物，使其与待扩增DNA序列互相补合，即退火。
延伸：加入DNA聚合酶和四种dNTP，使引物沿着单链DNA模板向3'端延伸，形成一条新的DNA链，即延伸。
如此反复进行三步操作，可使DNA分子不断扩增，形成指数级增长。
PCR的应用PCR技术已广泛应用于基础研究、临床诊断、法医学鉴定等领域。
基础研究：PCR技术可以扩增极小的DNA样品，如单个细胞或少量组织，从而对某些难以获取的DNA序列进行研究。
此外，PCR技术还可以用于构建DNA库、进行基因克隆、检测基因突变等。
临床诊断：PCR技术可以用于检测某些疾病相关的基因突变、病原体的存在等。
例如，PCR技术已经成为病毒性疾病、细菌感染等的诊断主要手段之一。
法医学鉴定：PCR技术可以对DNA进行扩增，从而获得足够的DNA 量进行鉴定。
例如，警方可以从犯罪现场收集到微量的DNA样品，通过PCR技术进行扩增，并与嫌疑人的DNA样品进行比对，以确定是否为犯罪嫌疑人。
PCR技术的改进与发展PCR技术自问世以来，经历了多次改进和发展。
其中最重要的一项改进是荧光定量PCR技术（Real-time PCR）。
荧光定量PCR技术可以在PCR反应过程中实时检测PCR产物的数量，从而能够对扩增结果进行准确的定量。
此外，还有多聚酶链式反应（Multiplex PCR）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等技术的出现，极大地拓宽了PCR技术的应用范围。
聚合酶链式反应
反应的控制
变性温度和时间 95℃，30s 退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间 72℃，1min/kb（10kb内） Tm值=4(G+C) +2(A+T) 循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有 效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性 逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后 在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Hale Waihona Puke 物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时 间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
PCR原理
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚 合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性 解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合 酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂 贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不 需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临 床。
聚合酶链式反应技术及其应用
聚合酶链式反应技术及其应用在生物科技领域，聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种非常重要的技术手段，它可以快速、准确地扩增DNA，应用广泛。
下面，我将详细介绍PCR技术的原理、操作方法以及应用。
一、PCR技术的原理PCR技术的核心是DNA扩增，扩增过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR反应具体流程如下：1. 变性：将DNA分子的双链分离成单链，这是PCR反应最重要的一步，因为只有在单链DNA的状态下，才可以实现DNA扩增。
变性时，将样品加热至95℃左右，使DNA分子双链断裂，形成单链状态。
2. 退火：将引物与模板DNA配对结合。
在引物含量过高的情况下，引物与DNA模板发生杂交，此时引物为20个碱基左右的短链DNA。
3. 延伸：在真核生物中，PCR反应中含有酶——聚合酶，它是从热温泉海洋微生物中提取的。
模板的DNA片段会在此时开始合成，固定引物会拓展其3’端，引物和模板组成的DNA模板将聚合物质合成DNA分子。
以上流程反复反应，就可快速扩增出含有想要的DNA碱基序列的DNA分子。
其中，引物的设计相当关键，因为只有用恰当的引物才能选择性地扩增出目标片段。
二、PCR技术的操作方法PCR反应仪是PCR技术的关键设备，这种设备非常专业，主要用于DNA扩增，一般比较昂贵，属于生物化学实验室的常备设备。
下面我将简单介绍PCR技术的操作步骤：1. 选择DNA模板：DNA模板通常来自于细胞、组织、疾病病源体等。
需要注意的是，DNA模板存在于原始样本细胞中，如果样品纯度不够高，浓度也不够，就不能很好地进行PCR反应，因此提取出DNA模板非常重要。
2. 设计引物：引物在PCR反应过程中发挥重要的作用，选择与预期扩增DNA片段保持完美匹配的引物非常关键。
引物设计时需要考虑引物长度、熔点、GC含量、引物特定性、杂交温度等因素，设计优秀的引物有助于提高PCR反应的特异性和灵敏度。
pcr扩增目的基因的原理
pcr扩增目的基因的原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种基于体外DNA增殖技术，能
在相对较短的时间内扩增出指定DNA序列的方法。
PCR扩增
目的基因的原理如下：
1. 反应体系：PCR反应液中包含目的DNA模板，DNA聚合酶、正反向引物、脱氧核苷酸和缓冲液等。
2. 反应步骤：
（1）首先，PCR反应液被加热到96℃以上，使DNA模板的
双链结构断开为单链。
（2）然后，反应液降温到50-65℃，以便引物结合到模板上。
正反向引物的5'-末端即可与目的DNA序列的3'-末端互补结合。
（3）接下来，反应液又被升温到72℃，以便DNA聚合酶将
脱氧核苷酸合成新链，并以模板为模板扩增出新的DNA分子。
3. 扩增结果：经过30-40个PCR周期，可以扩增出大约1亿
倍的目的DNA序列，其扩增产品可以使用各种方法检测和鉴别。
由于PCR技术可以在不依赖细胞的情况下扩增DNA序列，因此它在遗传学、疾病诊断、药物研发以及法医学等领域具有广泛应用价值。
pcr技术的原理与应用
PCR技术的原理与应用1. PCR技术概述聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种基因工程和分子生物学领域常用的技术。
它通过复制和扩增DNA片段，使之在数量上显著增加，从而更方便地进行进一步的实验操作和分析。
PCR技术具有高灵敏度、高选择性、高重复性和高效率等特点，广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。
2. PCR技术原理PCR技术基于酶的反应，利用DNA聚合酶酶的酶活性，在适宜的温度下，通过反复循环的核酸扩增步骤，可制备大量具有特定序列的DNA分子。
PCR技术的核心步骤包括：2.1 反应物准备•DNA模板：待扩增的DNA样本，可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA片段。
•引物（Primers）：引物是一段具有互补序列的DNA片段，用于界定扩增的DNA区域。
•核苷酸三磷酸酶（dNTPs）：供聚合酶合成新DNA链所需的四种核苷酸单元。
•聚合酶（DNA polymerase）：常用的PCR聚合酶有Taq聚合酶、Pfu聚合酶等。
2.2 反应步骤a.热变性（Denaturation）：加热使DNA双链解开，产生两条单链DNA。
b.引物结合（Annealing）：降温，使引物与目标序列的互补部分结合。
c.DNA合成（Extension）：提高温度，使聚合酶沿模板DNA链合成新的DNA链。
2.3 循环扩增上述三个步骤根据需要反复循环，通常为20-40个循环，每一循环使扩增的DNA量翻倍。
在较短的时间内，PCR技术能够合成大量特定DNA片段。
3. PCR技术的应用PCR技术已经在很多研究和应用领域得到了广泛的应用。
以下是PCR技术常见的应用示例：3.1 基因克隆PCR技术可用于在分子克隆中扩增需要的DNA片段。
通过引物的选择，可以在PCR反应中制备合成的DNA片段，用于进一步的分析和鉴定。
3.2 基因表达和蛋白质研究PCR技术可用于检测和定量特定基因的表达水平。
str-pcr原理
str-pcr原理
STR-PCR（短串联重复多态性-聚合酶链式反应）是一种用于分子生物学研究的技术，它利用聚合酶链式反应（PCR）来扩增DNA中特定的短串联重复序列。
这些短串联重复序列在人类基因组中具有高度变异性，因此被广泛用于遗传学研究和法医学鉴定。
STR-PCR的原理是首先从样本中提取DNA，然后选择特定的STR 位点进行扩增。
通常会选择多个STR位点来进行分析，以增加鉴定的准确性。
在PCR反应中，使用特定的引物来选择性地扩增目标STR位点的DNA片段。
扩增后的DNA片段可以通过凝胶电泳等方法进行分离和检测，从而确定不同样本之间的STR序列差异。
通过对不同样本的STR序列进行比对和分析，可以用于亲子鉴定、犯罪嫌疑人的身份确认、人口遗传学研究等领域。
STR-PCR技术因其高度灵敏和高度多态性的特点，被广泛应用于法医学和遗传学领域。
pcr-pira原理
pcr-pira原理PCR-PIRA原理引言:PCR-PIRA（Polymerase Chain Reaction with Primer-Induced Restriction Analysis）是一种常用的分子生物学技术，它结合了PCR和限制性内切酶切割的原理，用于检测、鉴定和分析DNA序列。
PCR-PIRA技术具有高度的灵敏度和特异性，广泛应用于基因突变检测、病原微生物鉴定、DNA指纹图谱构建等领域。
一、PCR原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外扩增DNA的方法，通过反复进行DNA的变性、引物结合和DNA合成三个步骤，使目标DNA序列得以放大。
PCR反应体系包括目标DNA 模板、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液等重要组分。
PCR反应主要由三个步骤组成：变性、退火和扩增。
在变性步骤中，PCR反应体系被加热至94-98°C，使DNA两链解开，形成单链模板。
在退火步骤中，反应体系降温至目标引物的退火温度，引物与目标DNA特异性结合。
在扩增步骤中，反应体系升温至聚合酶最适温度，聚合酶沿引物向5'→3'方向合成新的DNA链。
二、PIRA原理限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并切割DNA的酶。
PCR-PIRA技术利用引物引导PCR扩增得到特定DNA片段，然后使用限制性内切酶切割PCR产物，生成特定长度的DNA片段。
限制性内切酶的选择需要考虑PCR产物的大小和限制酶切位点的特异性。
通常情况下，PCR产物的大小在100-1000 bp之间，限制酶切位点应该位于PCR产物的内部，并且PCR产物与限制酶的切割位点之间应该有足够的距离。
通过PCR-PIRA技术，可以根据限制酶切割产物的大小差异，对不同的样品进行鉴定和分析。
三、PCR-PIRA原理PCR-PIRA技术结合了PCR和限制性内切酶切割的原理，通过扩增特定DNA片段并使用限制性内切酶切割产物，实现对DNA序列的检测和分析。
dna聚合酶链式反应
dna聚合酶链式反应DNA聚合酶链式反应（DNA Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在实验室中人工合成DNA的方法，其基本原理是通过重复的循环反应，使DNA的数量快速增加。
PCR技术的发明者是美国生物化学家凯瑟琳·穆利斯和基里尔·穆利斯。
PCR技术的应用范围非常广泛，包括基因检测、疾病诊断、法医学鉴定、分子生物学研究等领域。
在基因检测中，PCR技术可以用来检测特定基因的突变，从而帮助医生进行早期诊断和治疗。
在疾病诊断中，PCR技术可以用来检测病原体的DNA，从而帮助医生确定病因并选择合适的治疗方法。
在法医学鉴定中，PCR技术可以用来进行DNA指纹鉴定，从而帮助警方追踪犯罪嫌疑人。
在分子生物学研究中，PCR技术可以用来扩增特定的DNA片段，从而帮助科学家进行基因克隆和序列分析。
PCR技术的实施流程包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，将待扩增的DNA样本与引物（即DNA聚合酶链的起始序列）和酶（即DNA聚合酶）一起加入到PCR反应管中。
然后，将PCR反应管置于热循环仪中，进行循环反应。
在第一个循环中，将反应管加热至95°C，使DNA变性，即将DNA双链分离为两条单链。
在第二个循环中，将反应管降温至50-65°C，使引物与待扩增的DNA片段结合。
在第三个循环中，将反应管加热至72°C，使DNA聚合酶在引物的引导下，在待扩增的DNA片段上进行延伸。
通过不断循环这三个步骤，DNA的数量将指数级增加。
PCR技术的关键是DNA聚合酶，它是一种能够在体外合成DNA的酶。
DNA聚合酶的作用是将引物与DNA模板配对，然后在模板上合成新的DNA链。
在PCR反应中，使用的DNA聚合酶通常是从热泛菌属中分离出来的热稳定酶，如泛素聚合酶（Taq聚合酶）。
由于PCR反应需要在高温下进行，普通的DNA聚合酶无法耐受高温而失去活性，而热稳定酶可以在高温下保持活性，因此被广泛应用于PCR技术中。
PCR(聚合酶链式反应)原理
PCR(聚合酶链式反应)原理PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在T aq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。
这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。
如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。
而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。
到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。
这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。
PCR 的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI 诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
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Taq
l
R
Q
变性
Q 5’
Q 5’
Q 5’
Taq
5’
Taq
5’
R
R
Taq
R
Taq
R
l
R
3’
退火
1. 链取代
3’
5’
2. 水 解
3’
5’
3. 聚 合
3’
5’
4. 检测荧光
3’
• 标准曲线分析法
-学术活动-
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
-学术活动-
• 现代实验室大多使用RT-PCR技术检测某个 基因的表达。
• 逆转录（Reverse Transcription RT）是将 RNA转录成cDNA的过程。
• 为什么要进行逆转录？ • 为什么要提取RNA而非DNA？
逆转录示意图
-学术活动-
逆转录体系
-学术活动-
逆转录引物区别
-学术活动-
聚合酶链式反应技术
Polymerase Chain Reaction
常立功 2014-09-29
-学术活动-
• PCR的起源与发展 • PCR基本原理 • 普通PCR过程与分析 • 荧光定量PCR过程与分析
-学术活动-
• PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无 论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶 杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一 丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是 “微量证据”的威力之所在。
• 特异性引物：用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更 为特异的PCR扩增。
普通PCR反应体系
-学术活动-
普通 PCR示意图
3’
5’
5’
3’
Primers
d.NTPs
Taq 酶
反应组分
变性
3’ 5’
3’
Taq
5’
退
火
3’
5’
Taq
延
伸
3’
重
复
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’
• 1.Oligo(dT)18 ： 能与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异 性结合，适合真核生物mRNA的转录,尤其是新鲜的组织或 细胞，当所提取的RNA片段长度小于2kb,无复杂三级结构
• 随机六聚体引物：适用于mRNA内含抑制反转录酶活性的 终止序列，适合提取无Poly(A)尾巴的RNA、石蜡和破碎 组织内提取的RNA，特别是当提取片段超过2kb，内部有 复杂的三级结构的，
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
3’
循环2 X2个拷贝
5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’
3’
循环3 X3个拷贝
-学术活动-
PCR反应模式
普通PCR结果分析
-学术活动-
荧光定量PCR
-学术活动-
荧光染料法原理
3’
5’
5’
3’
Primers
d.NTPs Taq酶
• DNA在复制时，其中两条以氢键结合的互补链必须先行 分开，才能各自作为复制的模板；而打开双螺旋的最简单 方法就是加热。在高温下，双股DNA链会分离成单股，等 温度降低后，互补的两条DNA链又可以恢复成双股。虽然 DNA分子能耐高温，但进行DNA复制所需的聚合酶是蛋白 质，在高温下会失去活性。这也是之前的研究人员不认为 这种方法可行的原因之一。再有，要在千万条DNA当中， 以一小段已知序列制成的引物，“钓”出所需的片段，进 行复制，也跟大海捞针差不多，这是另一个让人却步的理 由。
SYBR Green I ID
反应组分
Taq
l ID
变性
3’
5’
退火
5’
3’
3’
ID
ID
Taq
5’
5’
Taq
ID
ID
ID
3’
l
3’
ID
l ID
l ID
Taq
ID
ID
l l
Taq 5’
3’
延伸 检测激发的荧光
TaqMan探针原理
3’
5’
5’
3’
Primers
d.NTPs
Taq酶
R Probe
Q
反应体系
• 标准曲线分析法
-学术活动-
unknown
104 103
相对定量分析
-学术活动-
无需制备标准品(2 -ΔΔc(t) 法)，但需要内参照基因， 且要求内参与目的基因扩增效率相近。
内参Ct值=15-14=1，21=2； 基因A: delta CT=20-18=2，22=4。 但是由于加样量是2倍，所以4/2=2，最后的相对 量是2倍
-学术活动-
• 1953年，DNA被发现是细胞里携带遗传信息的分 子。
• 1956年，第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合 酶（此时的基因扩增仅在实验室，小规模的扩增， 操作繁复，成本高）。
• 1973年，台湾人钱嘉韵在黄石公园里热泉中发现 的嗜热菌中并分离出耐热的Taq聚合酶。
• 1984年，美国人K. Mullis (穆里斯 )和日本人才木 共同奠定了现代PCR技术的基础，使PCR技术进 入普通实验室，前者在1993年获得诺贝尔化学奖