流式细胞仪---
流式细胞仪
流式细胞仪什么是流式细胞仪？流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生命科学领域的实验技术，它能够实现单细胞的快速分析、分类以及划分。
流式细胞仪的原理流式细胞仪的基本结构包括激光源、光学系统、电子学系统和计算机系统。
在样本准备完成后，激光量子将对待检测的细胞进行激励，细胞中的荧光标记物或颜料受到光的激发会发生发射，发射的光传递到光学系统后进行过滤处理后再通过相应接收器接收，传输到电子学系统和计算机进行分析和记录。
流式细胞仪在生命科学领域应用免疫细胞学免疫细胞学是流式细胞仪最广泛的应用领域。
通过对细胞表面分子的特异性检测来实现不同免疫细胞的鉴定和分类。
基于荧光标记同种或异种抗体的原理，使得负责流式细胞仪的计算机可以在短时间内分析千万级别的细胞数。
活细胞筛选通过流式细胞仪可以对生长期的细胞进行筛选，对不同阶段的细胞群体进行分离，可以实现对细胞的遗传和基因表达水平的研究。
分子生物学领域流式细胞仪在分子生物学领域中也起到关键的作用，它能够进行 DNA 浓度分析、测定蛋白质的表达量、检测RNA的表现等。
神经科学领域流式细胞仪还可以在神经科学领域发挥一定的作用，可以检测神经细胞在形态、力学、电生理性质等方面的变化。
流式细胞仪存在的不足流式细胞仪的存在也面临一些问题，例如因为激光的存在会对样本造成一定的损伤，需要非常小心地处理样本。
此外，部分实验者对于样本的操作技能要求较高，需要一定的专业知识和严格的操作规程。
总结流式细胞仪是一种非常有用的生命科学实验技术，主要应用于免疫细胞学、活细胞筛选、分子生物学以及神经科学领域等科学研究。
然而，由于激光的存在，样本操作技能的要求较高，需要仔细对待和操作。
《流式细胞仪》课件
流式细胞仪应在恒温条件下运行，以保证检 测结果的稳定性。
2023
PART 05
流式细胞仪的发展趋势与 展望
REPORTING技术创新与改进源自检测灵敏度提升01
通过改进光学系统和信号处理技术，提高流式细胞仪的检测灵
敏度，能够检测更低浓度的标记物。
多参数分析能力增强
02
采用多色荧光标记和光谱分离技术，实现多参数同时检测，能
流程
细胞样本经过特定的处理和染色后进入流式细胞仪，在液流 的作用下被引入测量区域，经过激光束的照射产生散射光和 荧光信号，信号经过光电转换和数字化处理后被分析。
流式细胞仪的应用领域
01
02
03
生物学研究
用于研究细胞生长、分化 、凋亡和功能等方面的机 制，有助于深入了解生命 过程和疾病发生机制。
医学诊断
用于控制仪器的工作流程，包括液 流系统、激光器等硬件设备的控制 。
样本制备
细胞样品处理
将待测细胞样品进行处 理，包括离心、洗涤、
染色等步骤。
荧光染料选择
根据实验需求选择适当 的荧光染料，用于标记 细胞表面或内部的抗原
或分子。
抗体标记
将荧光染料与抗体结合 ，形成荧光抗体，用于 标记细胞表面的抗原或
分子。
流动室和喷嘴
用于将细胞引入仪器，并使细 胞通过激光束。
光电倍增管
用于检测荧光信号和散射光信 号。
液流系统
用于控制细胞在仪器中的流动 速度。
软件系统
数据采集软件
用于采集和处理来自光电倍增管 的信号，将其转换为可分析的数
据。
分析软件
用于对数据进行统计分析，包括细 胞计数、细胞分群、细胞表型分析 等。
流式细胞仪
三）淋巴细胞分类
CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19 （B细胞）、CD16、CD56（NK细胞）， 原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫 性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观 察与预后判断、移植免疫检测等。
R1 M1 M1
流式细胞术检测细胞表型
四）白血病的免疫分型
流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素 标记的单克隆抗体作分子探针，多参数 分析白血病细胞的免疫表型，了解被测 白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
流式细胞仪数据分析
点图分析
流式细胞仪数据分析
直方图分析
图中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞
五、 流式细胞术的应用
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞
周期 RNA含量 蛋白质含量
……
细胞功能
UL
254
2.40 37.47 461.36
UR 1067 10.08 816.86 468.89
LL 5291 49.98 19.57 4.41
LR 3975 37.55 418.80 9.87
图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死
Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04
FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、 准确，重复性好，能区分细胞起源、划 分其分化发育阶段等，对白血病的诊断 与分型、治疗方案选择与预后判断、发 病机理研究等有重要价值。
最详细的流式细胞仪实验方法
最详细的流式细胞仪实验方法流式细胞仪（Flow cytometry）是一种高精度的细胞分析技术，可用于快速鉴定和分离多种类型的细胞。
本文将介绍一种常用的流式细胞仪实验方法，包括样品准备、细胞染色、细胞分析和数据分析等步骤。
一、样品准备1.收集细胞：制备单细胞悬液，如细胞培养物等。
2.细胞计数：使用细胞计数器或血细胞计数板等工具，计算细胞密度。
3. 调整浓度：根据流式细胞仪系统的要求，将细胞悬液的浓度调整至适当的浓度（一般建议在1×10^5至1×10^6个细胞/ ml之间）。
二、细胞染色1.封闭非特异结合位点：为了减少非特异性结合，可使用FBS（胎牛血清）或BSA（牛血清蛋白）等以阻断非特异位点。
2.添加荧光染料：选择合适的染料，如草酰胺（CFSE）、丙酮染料(ATTO)或FITC等。
按照厂家说明书中建议的浓度将染料添加到样品中，好洗脱或者可用来鉴定细胞的抗体，如表面标记、核酸染色剂或功能性抗体。
3.染色溶液：在4°C下孵育细胞悬液至少30分钟（具体时间根据实验需要决定）。
4.洗涤：向样本管中加入足够的缓冲液，使细胞悬液稀释五倍，并离心沉积细胞。
5.弃去上清液：将上清液弃去，然后用足够的缓冲液再次洗涤沉积的细胞。
6.重悬：向样品管中加入适量的缓冲液，使细胞形成合适的细胞密度。
三、设置流式细胞仪1.打开仪器：确保仪器已开启并运行正常，各通道和检测器已连接好，并预热至适当温度。
2.校正：根据仪器的手册，对流式细胞仪进行校正和标定，以确保流式细胞仪的准确性和稳定性。
3.样品管固定：将样品管插入到流式细胞仪中相应的槽中，以确保准确读取。
4.设置参数：在计算机或流式细胞仪仪器的界面上设置所需参数，如细胞个数、细胞染色等。
四、细胞分析1.利用流式细胞仪：启动流式细胞仪软件，并确保硬件与软件连接正常。
2.定位细胞：在细胞分析开始前，调整激光位置和侦测器的灵敏度，以确保对准确获取细胞。
流式细胞仪
Purdue University Cytometry Laboratories
流式细胞术的临床应用
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临床常见应用
1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态 2.白血病/淋巴瘤免疫分型
3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系
4.干祖细胞的定量及成分分析.
5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多态性检测;
• ②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、
化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；
• ③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、
计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多 领域的知识和成果；
• ④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
5
• 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流
22
• 目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为
488nm的激光器能够激发一种以上的荧光。光
源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，
所产生的荧光信号愈强。FITC的激发光谱如图
3-3所示， 488nm非常接近FITC的激发光谱的
峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信
号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发
的技术。从开始设想到第一台仪器的问世,科技工作者进行 了不懈的努力。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已 经成为日益完善的细胞分析和分选的工具。
2
• FCM仪器分为二大类：
• 一类为台式机，其特点为：仪器的光路调节系统固定，
自动化程度高，操作简便，易学易掌握。BD公司的临床 型 FACScan也是最早可用于临床诊断的仪器。
肿瘤癌基因及 抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶; 耐药蛋 白的分析等等。
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪的基本结构
流式细胞仪是一种广泛用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它可以用来分析和计数细胞、测定细胞大小、形状和复杂性，并检测细胞表面和内部分子的表达。
流式细胞仪的基本结构包括以下几个主要部分：
1. 激光系统，流式细胞仪使用激光来激发样品中的荧光染料或标记物，从而检测细胞的特定性质。
激光系统通常包括一个或多个激光器，用于产生不同波长的激光光束。
2. 样品注射系统，样品注射系统用于将待测样品引入流式细胞仪。
通常采用注射器或者自动进样系统来实现样品的引入。
3. 流动系统，流动系统包括样品的流动通道、流速控制装置和检测单元。
样品在流动通道中通过激光束，检测单元用于测量样品中的荧光信号。
4. 检测单元，检测单元包括光学透镜、滤光片和光电探测器，用于接收样品中的荧光信号，并将其转换为电信号。
5. 数据分析系统，数据分析系统用于处理和分析从检测单元中获得的数据，通常包括计算机和相应的软件。
流式细胞仪通过这些基本结构的协同作用，可以实现对细胞的高速、高通量、多参数分析，为生物医学研究和临床诊断提供了强大的工具。
随着技术的不断进步，流式细胞仪的功能和性能也在不断提升，使其在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等领域的应用变得更加广泛和深入。
流式细胞仪
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
目录* 1 原理* 2 流式细胞仪(flow cytometer)* 3 应用* 4 参见原理一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。
若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。
当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。
这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。
前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。
可以检测的参数有：细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等）流式细胞仪(flow cytometer)流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。
现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。
流式细胞仪名词解释细胞生物学
流式细胞仪名词解释细胞生物学篇一：流式细胞仪，这在细胞生物学里可真是个超酷的玩意儿呢。
你要是把细胞世界想象成一个超级大的城市，那流式细胞仪就像是这个城市里最厉害的超级侦探。
细胞啊，那可是非常非常小的东西，小到咱们肉眼根本就看不见。
它们就像这个城市里数不清的小居民，每个细胞都有自己的特点和秘密。
流式细胞仪呢，就能够一个一个地去查看这些小居民。
它怎么做到的呢？就像是给每个细胞发了一张特殊的身份证一样。
这个特殊的身份证就是细胞表面或者内部的一些特殊的标记。
比如说，有的细胞可能会带着一种特殊的蛋白质，就像居民戴着一个独特的徽章。
流式细胞仪就能识别出这个徽章。
它就像一个超级灵敏的扫描仪，在细胞的海洋里快速地游动，看到一个细胞就扫描一下。
流式细胞仪工作的时候可有趣啦。
它就像一个流水作业的大工厂。
细胞就像一个个小零件被送进这个工厂。
细胞在一个一个地通过这个仪器的时候，仪器就会给它们进行各种各样的检测。
就好比是在流水线上，每个小零件都要经过质量检测一样。
在细胞生物学的研究里，流式细胞仪的作用可大了。
比如说，科学家们想要知道在一群细胞里，有多少个细胞是正在分裂的。
这就像是在一个大社区里，想知道有多少居民正在搬家一样。
流式细胞仪就能很轻松地把正在分裂的细胞找出来，因为这些细胞会有一些特殊的表现，就像正在搬家的居民会有一些特别的动静。
又比如说，科学家想知道细胞有没有受到病毒的感染。
这就像是在城市里检查居民有没有被坏蛋欺负一样。
如果细胞被病毒感染了，那它的身体里就会有一些不一样的地方，流式细胞仪就能发现这些不一样，就像侦探能发现居民被欺负后的蛛丝马迹。
流式细胞仪真的是细胞生物学研究中不可缺少的得力助手啊。
没有它，科学家们要想了解细胞的各种秘密，那就像在黑暗里摸索，太难了。
所以啊，它就是打开细胞世界大门的一把超级钥匙，让我们能够更好地认识细胞这个奇妙的小世界。
在细胞生物学的研究道路上，流式细胞仪就是那盏照亮前方的明灯，带领着科学家们不断探索细胞的奥秘。
流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展
流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展一、本文概述流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）作为一种先进的细胞分析技术，自其诞生以来，在生物医学领域发挥了重要的作用。
本文旨在全面概述流式细胞仪的发展历史，深入剖析其基本原理，以及探讨其在不同领域的应用进展。
我们将从流式细胞仪的初步概念出发，追溯其技术的演进过程，分析其在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等领域的应用实例，并展望未来的发展趋势。
通过对流式细胞仪的深入研究，我们希望能够为相关领域的研究人员提供有价值的参考，推动流式细胞仪技术的进一步发展。
二、流式细胞仪的发展历史流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速测量和分析细胞特性的高科技仪器。
自其诞生以来，流式细胞仪在生物医学研究领域发挥了重要作用，其发展历史可追溯至20世纪60年代末。
1965年，美国科学家Wallace H. Coulter首次提出了流式细胞仪的基本概念，并设计出了第一台原型机。
这台机器利用了液流原理和荧光检测技术，可以对单个细胞进行快速、定量的分析。
1970年，Coulter Science公司正式推出了世界上第一台商用流式细胞仪，标志着流式细胞技术的诞生。
随着科技的进步，流式细胞仪在随后几十年中经历了不断的改进和创新。
在硬件方面，流式细胞仪的激光源从最初的单一波长发展到多波长，甚至引入了紫外、红外等多种激光，使得可以同时检测多种细胞参数。
在软件方面，数据分析和处理能力得到了显著提升，可以实现对大量数据的快速、准确分析。
流式细胞仪的应用领域也不断拓宽。
从最初的免疫学研究，到现在的肿瘤学、细胞生物学、分子生物学等多个领域，流式细胞仪已经成为了不可或缺的研究工具。
随着单细胞测序技术的发展，流式细胞仪与单细胞测序技术的结合，为深入研究细胞异质性和疾病发生机制提供了新的手段。
流式细胞仪的发展历史是一部科技进步的缩影。
从最初的原型机到现在的多功能仪器，流式细胞仪在硬件、软件和应用领域都取得了显著的进步。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪是一种用于细胞分析和分类的仪器。
它通过将细胞单个地以高速通过一个光束，并测量其多个特性，从而对细胞进行识别、计数和分析。
其基本工作原理如下：首先，细胞样品被制备成单细胞悬浮液，并通过细胞特异性的染色物质或标记物进行标记，以将目标细胞与其他细胞区分开来。
然后，样品被注入到流式细胞仪中，通过注射器控制样品的流速和流量。
在流式细胞仪内部，样品被推进到一个称为流动细胞室的地方。
在流动细胞室中，样品通过一个狭窄的玻璃管道，产生一个细细的流动。
该管道上方有一个光源，通常是一束激光。
这束激光被聚焦成一束光束，对通过的细胞进行照射。
当细胞通过激光束时，它们与激光发生相互作用。
细胞中的标记物会吸收激光的能量，并重新发射出来。
这些重新发射的光信号被称为荧光信号。
荧光信号与细胞的特征和标记物有关。
流出流动细胞室的细胞荧光信号被收集并分析。
收集荧光信号的方法是通过使用一组光学器件，如透镜和滤光器，将荧光信号定向到光电倍增管中进行光电转换。
光电倍增管会将光信号转化为电信号，并放大。
最后，通过分析仪器中的电子元件收集的荧光信号和流速的数据，可以得出关于细胞数量、大小和标记物强度等的信息。
这
些信息可被用于鉴定和分类细胞，分析细胞的功能和活性，以及研究细胞的生理和病理状态。
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器，可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。
细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制，而在疾病发生时，细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。
因此，对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。
本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。
实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI（胰岛素脱羧酶）Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先，将培养好的细胞分到不同的培养皿中，添加凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡。
凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。
通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。
2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后，使用离心机将细胞沉淀下来，并用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。
然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。
3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中，用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度，并将细胞密度调整到合适的浓度。
4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中，添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。
荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC，它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合，从而可以用于检测凋亡细胞；PI荧光染料用于检测坏死细胞。
5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀，然后在室温下孵育一定时间，通常为15-30分钟。
期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。
6.流式细胞仪检测染色反应结束后，将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，通过流式细胞仪的激光和光电探测器，可以分辨出细胞的荧光和散射信号，从而获得细胞凋亡的信息。
使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试，以确保获得准确和可靠的数据。
流式细胞仪原理及应用
流式细胞仪原理及应用流式细胞仪（flow cytometry）是一种高效、高通量、多参数的细胞分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域。
本文将介绍流式细胞仪的原理及其在生命科学研究中的应用。
流式细胞仪的原理主要基于细胞对激光光束的散射和荧光信号的检测。
当细胞悬浮在流式细胞仪的流动系统中通过激光束时，细胞会散射出前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。
FSC反映了细胞的大小，而SSC反映了细胞的复杂性和颗粒度。
此外，流式细胞仪还可以检测细胞内荧光标记物的荧光信号，通过这些信号可以对细胞进行多参数分析，包括细胞表面标记物、细胞周期、DNA含量、细胞凋亡等。
在生物医学研究中，流式细胞仪被广泛应用于细胞表型分析、细胞凋亡检测、细胞周期分析、免疫细胞表型分析等领域。
例如，研究人员可以利用流式细胞仪对肿瘤细胞进行表型分析，以了解肿瘤细胞的表面标记物表达情况，从而为肿瘤治疗提供依据。
此外，流式细胞仪还可以用于检测细胞内钙离子浓度、ROS生成、线粒体膜电位等生物学参数的变化，为细胞功能研究提供重要数据支持。
在临床诊断中，流式细胞仪被广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学等领域。
例如，流式细胞仪可以用于血液细胞分型、白血病和淋巴瘤的诊断与分型、免疫细胞表型分析等。
通过对患者血液或组织样本的流式细胞分析，临床医生可以更准确地诊断疾病类型，评估疾病预后，指导治疗方案的选择。
另外，流式细胞仪还被广泛应用于药物研发领域。
研究人员可以利用流式细胞仪对药物对细胞的影响进行评价，包括细胞毒性、细胞凋亡诱导、细胞周期阻滞等。
通过流式细胞仪的高通量分析，可以快速筛选出具有潜在药物活性的化合物，为新药研发提供重要的支持。
总之，流式细胞仪作为一种高效、高通量、多参数的细胞分析技术，在生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和完善，相信流式细胞仪将在未来发挥更加重要的作用，为生命科学研究和临床医学带来更多的突破和进步。
流式细胞仪操作步骤
流式细胞仪操作步骤一、样品准备1. 确认样品是否符合实验要求，如细胞浓度、荧光标记等。
2. 根据实验需求，选择合适的试管和细胞样品。
3. 确认样品中是否有杂质或污染物，必要时进行离心和洗涤。
4. 尽可能缩短样品处理时间，避免细胞活性受到影响。
二、样品上机1. 打开流式细胞仪，确认仪器正常工作。
2. 将样品加入到流式细胞仪的样品管中。
3. 根据实验需求，设置合适的流速和压力。
4. 开始采集数据，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
三、参数设置1. 根据实验需求，选择合适的荧光标记和检测参数。
2. 根据细胞类型和特性，设置合适的门控和阈值。
3. 确认仪器校准和定标工作已完成。
4. 根据需要，设置多色分析，以便于进行细胞分群和定量分析。
四、数据采集1. 在采集数据时，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。
2. 根据实验需求，确定采集的数据量，确保数据具有代表性。
3. 记录采集数据的时间和条件，以便于后续数据分析。
4. 在采集数据时，注意观察细胞活性、浓度和分布情况，及时调整实验条件。
五、数据分析1. 使用专业软件对采集的数据进行处理和分析。
2. 根据实验需求，对数据进行去噪、归一化和定量分析。
3. 进行细胞分群、细胞周期和细胞凋亡等分析。
4. 对数据进行统计学分析和可视化展示。
六、结果输出1. 根据分析结果，输出相应的图表和数据表格。
2. 对结果进行解释和注释，以便于读者理解和应用。
3. 如果需要，可将结果整理成报告形式，提供给相关人员参考和使用。
七、质量控制八、实验室清理。
1流式细胞仪基础知识介绍
1流式细胞仪基础知识介绍流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种通过流式技术对细胞进行快速分析和计数的仪器。
它结合了光学、电子和计算机技术，可以对单个细胞进行高效的多参数分析，可广泛应用于生命科学研究、临床诊断、药物研发等领域。
流式细胞仪的基本原理是通过激光束照射样本中的细胞，并利用光学系统收集和分析由细胞散射、荧光等产生的光信号。
其主要组成部分包括激光器、光学系统、流体系统和电子计算机系统。
激光器是流式细胞仪的光源，产生高强度的单色激光束。
常用的激光器有氩离子激光器、固态激光器和半导体激光器等，不同波长的激光器可用于激发不同荧光染料。
光学系统包括一系列透镜和滤光片，用于聚焦和收集激光束，并选择感兴趣的荧光信号进行检测。
透镜系统可以调整激光束的聚焦位置和扩展角度，使样品中的细胞逐个通过激光束。
流体系统通过将样品溶液注入流式细胞仪的流体管道中，使细胞以单个细胞的形式通过激光束，避免了背景信号的干扰。
流体系统还可以调节细胞的流速，以控制细胞之间的间隔，避免细胞重叠。
电子计算机系统是流式细胞仪的核心部分，用于控制仪器的运行和获得并分析光信号。
通过相应的软件，可以对细胞进行多参数分析，如细胞大小、形态、DNA含量、荧光标记等。
在流式细胞仪中，细胞通过激光束照射后，会产生散射光和荧光光信号。
散射光主要分为正向散射光（Forward Scatter，FSC）和侧向散射光（Side Scatter，SSC）。
FSC信号反映细胞的大小和复杂度，SSC信号反映细胞内部的结构和颗粒物质。
这些散射光信号可以提供有关细胞的一些形态信息。
荧光染料是流式细胞仪中常用的标记物质，通过与细胞中的特定成分结合，可以用来标记不同的细胞类型、活性分子和细胞内的蛋白质等。
荧光染料在激发后发出特定的荧光信号，可以通过滤光片选择性地收集和检测。
通过同时使用多种荧光染料，可以对不同的生物学参数进行同时分析。
流式细胞仪的数据分析可以通过绘制细胞密度分布曲线、细胞聚类分析、细胞亚群分析等方法进行。
流式细胞仪名词解释
流式细胞仪名词解释
流式细胞仪是一种用于检测和分离细胞类型的高精度仪器,通过利用液滴的运动方式来检测和测量细胞的类型和数量。
以下是流式细胞仪的一些常见名词解释:
1. 液滴:流式细胞仪中用来检测和测量细胞类型的流动装置,通常由一个光源和一个接收器组成,通过光源将光信号转化为电信号,接收器则将电信号转换为细胞类型的标志。
2. 表面活性剂:流式细胞仪中使用的表面活性剂可以增强细胞表面的黏附性和细胞黏附蛋白的表达,从而更好地分离不同类型的细胞。
3. 细胞模板:流式细胞仪中使用的模板用于固定和标记细胞,以便更好地进行分离和分析。
模板可以是固定化的DNA片段、蛋白质片段或细胞黏附蛋白片段等。
4. 细胞筛选器:流式细胞仪中的筛选器用于筛选特定的细胞类型或细胞系,例如通过选择特定的细胞模板或表面活性剂来分离不同类型的细胞。
5. 细胞分离液:流式细胞仪中使用的分离液用于将不同类型的细胞分离开来,通常包括一些表面活性剂、染料或其他添加剂,以便更好地区分不同类型的细胞。
6. 细胞计数器:流式细胞仪中用于测量细胞数量的工具,通常是一个微流控芯片,可以实时监测液滴的运动,并将运动信号转换为数字信号,从而进行细胞计数。
流式细胞仪是一种高精度、高效率的仪器,可以用于检测和分离各种类型的细胞,有助于医学研究和细胞生物学研究等领域的发展。
随着技术的不断发展,
流式细胞仪的应用范围也在不断扩大。
流式细胞仪行标
流式细胞仪行标
流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）是一种用于分析和分离活细胞的实验室技术。
它可以用来测定细胞的大小、复杂性（颗粒度）、内部荧光强度以及细胞表面或内部的特定分子标记。
流式细胞仪的工作流程大致包括以下步骤：
1. 样本制备：首先需要将细胞样本制备成单细胞悬液，并加入荧光染料或抗体以标记目标分子。
2. 染色：细胞悬液与荧光标记的抗体或染料混合后，孵育一段时间以使标记物结合到目标细胞上。
3. 样本加载：经过染色的细胞样本通过流式细胞仪的样本输入系统，通常是一个细管，称为流道。
4. 液流形成：细胞样本被雾化成单个细胞的液滴，这些液滴通过流道以一定速度流动。
5. 激光照射：流动中的细胞逐个经过激光束的照射。
激光激发细胞内或表面的荧光标记，使其发出光信号。
6. 信号检测：流式细胞仪配备有光电探测器，用来检测细胞发出的光信号。
每个细胞产生的信号被转换为电信号，并记录下来。
7. 数据分析：收集到的信号被计算机系统分析，根据细胞的荧光强度和散射光特性，可以得到细胞的各种参
数，如细胞大小、颗粒度、细胞膜和胞内分子的表达水平等。
8. 数据呈现：分析结果通常以二维图表（如前向散射与侧向散射图、荧光强度直方图）或三维/四维图表的形式展现，便于研究者进行进一步的数据解读和实验设计。
流式细胞仪广泛应用于免疫学、肿瘤学、细胞生物学等领域，对于疾病诊断、细胞分选、功能性研究等方面有着重要作用。
通过精确地测量和分析细胞的物理和化学特性，流式细胞仪能够提供关于细胞状态和功能的丰富信息。
流式细胞仪概述
由右图可知，空气泵 产生压缩空气，通过鞘 流压力调节器加在鞘液 上一恒定的压力，这样 鞘液以匀速运动流过流 动室，在整个系统运行 中流速是不变的。
（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定
（三）光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。 滤光片主要分为： 1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以上的光通过。 2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。 3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长范围内的光通过
（四）信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内
二、流式细胞仪细胞分选原理
在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串 均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流 式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴 充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电 场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指 定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。
二、常用的荧光染料与标记染色
散射光信号是激光照在细胞上所产生的前向光和侧向光 信号。荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特 异性荧光标记染色后通过激光束激发后所产生的。 因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染 料染色后才能上机进行检测。
焦宁Y与异硫氰酸荧光素（FITC，530nm）分别是RNA与 蛋白质的特异性染料；
（五）细胞分选器
1．小水滴的形成 压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。
喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径 为50μm时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。 若每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一 个水滴是有细胞的，其他皆为空白。
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3.流式细胞仪系统结构
2.激光光源与光学系统
FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波 长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤光片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光） FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪
目 录
1.流式细胞术概述
2.流式细胞仪概述
3.流式细胞仪系统结构
4.流式细胞仪软件介绍
5.流式细胞仪其它
1.流式细胞术概述
1.流式细胞术概述
流式细胞术定义 流式细胞术发展史 流式细胞术特点
1.流式细胞术概述
1.流式细胞术定义：
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM或 FACS)：是利用流式细胞仪 对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、 快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞术是一项新型的、发展迅速的生物医学分析技术,它是集 激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧 光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。
1.流动室和液流系统
流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交 液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器
3.流式细胞仪系统结构
流动室：
流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透 明、稳定的材料制作
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出; 鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出; 流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2.流式细胞仪概述
2.流式细胞仪概述
流式细胞仪定义 流式细胞仪的发展史与商品化 流式细胞仪的生产厂家
流式细胞仪的分类
BD公司、Beckman公司的分析仪及分选仪外观
2.流式细胞仪概述
贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪
2.流式细胞仪概述
1.流式细胞仪定义：
流式细胞仪(Flow Cytometor, FCM)是以流式细胞术为核心技术，对 高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主 要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采 集和分析技术等。
2.流式细胞仪概述
4.流式细胞仪生产厂家：
目流式细胞仪生产厂家主要有 BD、Beckman Coulter、Partec、 Guava、Union Biometrica、ABI、Amnis 等等。
美国 BD、Beckman Coulter 和德国的 Partec 占领着流式细胞仪市 场的统治地位。 BD、Beckman Coulter 产品型号种类齐全，占市场份额较大，如： 经济普及型流式细胞仪 ：FACSCount、Cytomics FC500 ； 大型科研型流式细胞仪： BD FACSAria、EPICS ； 特点：产品价格昂贵，我国使用的单位基本上是科研机构。 Partec 产品结构紧凑，造价低，便于携带，适合边远地区和发展 中国家，在植物学的研究中占有较大份额。Partec 公司的 CyFlow 于2004 年 1 月进入太空站用于研究工作，成为世界上首台升上太空 的流式细胞仪，证明其结构紧凑，性能优越的特点。
3.流式细胞仪系统结构
荧光激发及发射原理
特点：荧光方向与SSC相同，SSC的波长与激发光波长相同，荧光波 长比激发光波长要长（双色反射镜和带通滤光片将二者分开）
3.流式细胞仪系统结构
常用荧光染料的特性
荧光染料 FITC 激发波长 (nm) 488 发射波长(nm) 525 用途 免疫荧光 颜色 绿色
2.流式细胞仪概述
Beckman公司的流式细胞分析仪
2.流式细胞仪概述
Beckman公司的流式细胞分选仪：
3.流式细胞仪系统结构
3.流式细胞仪系统结构
流动室与液流系统 激光光源与光学系统 信号检测与分析系统 分选系统
3.流式细胞仪系统结构
流 式 细 胞 仪 结 构 图
3.流式细胞仪系统结构
3.流式细胞仪系统结构
流体的动力学聚焦
3.流式细胞仪系统结构
液流系统：
由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单 抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动 室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包 裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置 ，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。
3.流式细胞仪系统结构
3.信号检测与分析系统
信号检测系统由特异信号检测器件和非特异信号检测器件构成。 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同 物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度 立体角发射，产生非特异的散射光和特异的荧光信号。 荧光信号由PMT检测,前向角散射光信号由光电二极管检测。
3.流式细胞仪系统结构
散射光的测定：
细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信 号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分 为前向角散射光和侧向角散射光。
3.流式细胞仪系统结构
前向角散射光（FSC:forward scatter）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等 粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
2.流式细胞仪概述
•1983年：Shapiro 认为多参数分析流式细胞仪可以实现。此后，流式 细胞仪进入一个快速发展的时期； •1994年：美国Cytomation公司推出高性能、高速分选装置MoFlo，该 机以出色的性能和创新设计理念，一经推出即受到广泛关注； •2008年：美国BD公司推出Influx，在MoFlo基础上实现了原位、立 体分选。
2.流式细胞仪概述
5.流式细胞仪分类：
临床型：光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易掌握， 适用于临床常规测试；
科研型：分辨率高，选配多种波长和类型激光器，可将感兴趣细胞 分选到特定培养孔或板上，适用于科研。
2.流式细胞仪概述
BD公司的流式细胞分析仪
2.流式细胞仪概述
BD公司的流式细胞分选仪
侧向角散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
3.流式细胞仪系统结构
测得的FS与SS信号通 过计算机处理，可得到 FS-SS图，由此可仅用散 射光信号对未染色的活 细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基 本原理，但不能分析表 面分子。
单核细胞
中性粒细胞 淋巴细胞
光散射测量最有效的用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
3.流式细胞仪系统结构
荧光测量
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射 的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性 滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍 增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 荧光素与特异抗体结合，荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧 光信号越强
PE(RD1)
ECD PeCy5
488
488 488
575
620 675
免疫荧光
免疫荧光 免疫荧光
橙色
橙红 红
PI
PECy7 PerCP
488
488 488
620
755 670
DNA染色
免疫荧光
橙红
深红
APC
633
670
3.流式细胞仪系统结构
荧光信号线性测量和对数测量
线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、 总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。 对细胞膜表面抗原等参数进行荧光检测时，通常使用对数放大器。
1.流式细胞术概述
3.流式细胞术特点：
•分析对象：单细胞悬液或生物颗粒 •分析速度：快速，最高达上万个细胞/秒 •检测参数：多参数（两个散射光参数、多个荧光参数） •可同时测定多种可溶性细胞成分：流式微球芯片技术（Cytometric Beads Array,CBA） •检测结果：精度高、准确性好 •先进的细胞定量技术
3.流式细胞仪系统结构
前向角散射光示意图
Laser
FALS Sensor
3.流式细胞仪系统结构
侧向角散射光(SSC:side scatter):激光束照射细胞时，光以90° 角散射的讯号，与细胞精细结构和颗粒性质有关，对胞膜、胞质、 核膜变化更敏感，用于检测细胞内部结构属性。
3.流式细胞仪系统结构
2.流式细胞仪概述
2.流式细胞仪的发展史与商品化：
•1953年：Parker 和 Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置，成为流 式细胞仪的雏型； •1969年：Van Dilla Fulwyler 发明第一台荧光检测细胞计； •1970年：Phywe研制脉冲细胞光度计，备有荧光镜的FCM，DNA定 量；同年Kamensky发明白细胞分类流式细胞仪，激光光源，吖啶橙 染色，测定淋巴、单核、中性粒C； •1972年： Len Herzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分选仪 （FACS），氩离子激光，标志着流式细胞仪商品化时代到来； •1973年： Becton Dikinson (BD)公司投入市场，第一台FACS-Ⅰ问世， 其 后 2 0 多 年 来 不 断 改 进 完 善 产 品 ， 先 后 推 出 FA C S A n a l y z e r 、 FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-Ⅱ、FACSVantage、FACSDiva、 FACSAria等； •1975年： Kochler 和 Milstein 提出单克隆抗体技术，为细胞研究中 大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础；鉴于商业仪器的发展;