植保生物技术

结果分析
提取含量： ① 1.9ng/μl ② 1.6ng/μl
结果分析： 提取DNA浓度太低，可能原因： 1、处理材料时，研磨不够充分。 2、向吸附柱加入Buffer GE，溶解DNA不够充分。
实验三：新疆石河子地区烟粉虱 Q型生物型的PCR扩增
PCR反应体系：
PCR Mix 中 含 有 Taq DNA Polymerase，PCR Buffer，dNTP 及PCR反应的优化剂和稳定剂
四、思考题
1.通过组织培养获得离体植株再生体系通常有 几种途径？ （1）外植体→愈伤组织→根、芽→再生植株 （2）外植体→胚状体→ 再生植株
2.为什么选择外植体时选取胡萝卜根部形成层部分？
因为胡萝卜形成层分生能力强,形成层有大量的纺锤状 原始细胞和射线原始细胞,它们平周分裂迅速,组培时容易形 成愈伤组织,继而获得组培苗。而在形成层两侧的木质部 （形成层外侧）和韧皮部（形成层内侧）都没有原始细胞, 很难形成愈伤组织。
三、实验结果
培养基中植物激素比例： 2,4-D：0.5mg/L KT：0.5mg/L

结果分析：由于消毒过度，导致胡萝卜外植体裸露部 分被杀死，呈现白色
Medium (Group)
A B C D E F G
Plant hormones(mg/L)
2,4-D
KT
0
0
0
0.5
0.5
0
0.5
0.5
1.0
体系1பைடு நூலகம்
体系2
一般情况下，采用体系1；DNA浓度过低时采用体系2
反应程序：
1、预变性 94℃ 4min 2、变性 94℃ 30s 3、退火 50℃ 30s 4、延伸 72℃。 1min 5、第2-4 循环 5次
6、变性94℃。 30s 7、退火55℃ 30s 8、延伸72℃ 1min 9、第6-8 循环30次 10、72℃。 10min 11、4℃ forever。
实验一：胡萝卜直根愈伤组 织的诱导
一、实验目的
1. 熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试 剂，巩固相关理论基础知识并掌握相关技能。 2. 熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，并 且基本掌握愈伤组织的诱导培养。 3. 了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。
二、实验原理
植物细胞全能性是植物组织培养的细胞基础。 生活的植物细胞只要有完整的膜系统和细胞核， 它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传 信息，在适当条件下，这些信息可以表达，再生 成一个完整植株。
三、实验方法
连接体系
pMD18-T
0.5 µL
SolutionI
5.0µL
胶回收DNA模板 4.5µL
Total volume
10 µL
4℃连接过夜或者16℃连接4小时后进行热激转化。
四、实验结果
重组子质粒的双酶切
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
VDAG_04636重组子质粒双酶切凝胶图片 （目标片段600bp，载体片段2300bp）
实验二、新疆地区烟粉虱DNA 的提取
背景
目前广泛分布的入侵烟粉虱即所谓的“B 型” 和“Q 型”。
由于 Q 型烟粉虱入侵历史很晚，但传播速度很 快，具有更强的抗药性，在高浓度药剂选择的压力 下，世界多个国家和地区 Q 型烟粉虱逐渐取代 B 型 烟粉虱成为当地优势种群。新疆于 2011 年首次 报道 Q 型烟粉虱入侵。
实验目的
由于不同生物型的烟粉虱从形态学上很难区分，分子生 物学技术就成为其鉴定的有效方法。
本研究采用烟粉虱 mtDNA COⅠ（线粒体DNA(mtDNA)上细 胞色素氧化酶辅酶Ⅰ(COⅠ) ）基因作为分子标记，对新疆 （石河子地区）烟粉虱种群进行检测，明确新疆石河子地区 烟粉虱的生物型组成。
实验步骤
0
1.0
0.5
1.0
1.0
诱导率
83.3% 0% 34% 4% 4% 30% 0%
结果表明： ① A（即不加任何植物激素）的诱导率最高。 ② B、D、F进行比较，其他条件不变的情况下， 2,4-D含量越好，诱导率越高。 ③ AB,CD,EFG分别进行比较，2，4-D浓度相同时， 2,4-D浓度＞KT浓度时，诱导率较高。
合酶同时具有的末端连接酶的功能,在每条 PCR 扩 增产物的 3` 端自动添加一个 3`-A 突出端。利用 TaKaRa 的 T 载体，直接高效地连接 PCR 产物。
TA 克隆不需使用 含限制酶序列的引物， 不需将 PCR 产物进行 优化，不需把 PCR 产 物做平端处理，不需 在 PCR 扩增产物上加 接头，即可直接进行 克隆。
载体片段： 2300bp
目标片段： 600bp
实验结果
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
PCR扩增结果
结果表明：无扩增片段 结果分析：1、提取的DNA浓度过低
2、延伸时间过短。 3、只加了Q型引物，烟粉虱的生
物型可能是B型
实验四：基因的克隆
一、技术路线
二、实验原理
TA克隆（Original TA Cloning Kit） TA克隆又叫T—载体克隆，是利用利用 Taq 聚
1．材料处理，匀浆前向样本中加入不超过50 μl Buffer GTL，匀浆后加 入 100 μL Buffer GTL。
2．加入20 μl Proteinase K，涡旋荡使样品彻底混匀。56℃水浴2小时， 直至组织完全裂解，孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样 品分散。
3．加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡震充分混匀，加入200 μl无水乙醇， 涡旋震荡充分混匀。
6．向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙 醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放 回收集管中。
7．12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分 钟，以彻底晾干。
8．将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空 加入50-200 μlBuffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10,000 rpm离 心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
4．短暂离心，将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱 （Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。 10,000 rpm（～13,400×g ）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸 附柱重新放回收集管中。
5．向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙 醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放 回收集管中。