杆状病毒AcMNPVp48基因在昆虫细胞中的表达_袁美妗
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［ 9］
杆状病毒是昆虫专一性的病原体， 是发现最早 、 研究得最多且最为深入的昆虫病毒
［ 1 － 2］
。 杆状病毒
在农业 、 基础分子生 物 学 以 及 医 学 领 域 都 具 有 重 要 杆状 病 毒 是 控 制 昆 虫 种 群 的 重 要 生 的价值 。 首先， 可开发 成 生 物 杀 虫 剂 加 以 利 用 物因子，
palpus NPV 外的所有 杆 状 病 毒 中 均 存 在， 意味着该 基因可能具备重要功能 。 目前， 关于 p48 基 因 的 研 究 报 道 很 少 。 我 们 之 前 通 过 ET 重 组 技 术 从 AcMNPV bacmid （ 简 称 AcBac ） 中敲除该基 因， 构 建 成 缺 失 p48 基 因 的 重 组 AcMNPV［13 ］。 通过 对 该 重 组 病 毒 的 研 究 发 现， p48 基因是病毒复制的 必 需 基 因：在 该 病 毒 转 染 的 细 胞 中不 能 产 生 子 代 病 毒， 包 括 芽 生 型 病 毒 （ budded virus ，BV ） 和 包 埋 型 病 毒 （ occlusion-derived virus ， ODV ）
［ 3 － 5］
； 其 次，
杆状病毒还可作为外源基因表达载体系统表达外源 基因， 在药物研发 、 疫 苗 生 产 等 方 面 有 广 泛 的 应 用， 现已成 为 基 因 工 程 四 大 表 达 载 体 系 统 之 一 一种很 有 应 用 前 景 的 基 因 转 移 载 体
［ 7］ ［ 6］
。 比较 这 些 病 毒 基 因 组 的 序 列， 发
等构 建 1. 1. 2
［ 13 ］
； 大 肠 杆 菌 （ Escherichia coli ） DH10B 购 自
Invitrogen Corporation ， TG1 为本室保存 。 昆 虫 细 胞 和 血 清、 培 养 基： 草 地 贪 夜 蛾 （ Spodoptera frugiperda ） 细胞 Sf9 引 自 英 国 自 然 环 境 研 究 委 员 会 病 毒 研 究 所 （ NERC / Institute of Virology ，Oxford ，UK ） ； Grace's 培 养 基 和 胎 牛 血 清 （ fetal bovine serum ） 购自 Invitrogen Corporation ， 使用 时在 Grace's 培 养 基 中 添 加 10% 胎 牛 血 清 、 终浓度 为 100 μ g / mL 的青 霉 素 和 30 μ g / mL 的 链 霉 素， 双 无 培 养 基 即 为 无 血 清 无 抗 生 素 的 Grace's 培 养 基； LB 培养基参照文献［ 16 ］ 。 1. 1. 3 T4 DNA 主 要 试 剂 和 仪 器： 限 制 性 内 切 酶 、 Premix Ex Taq Hot Start Version PCR 试剂盒 连接酶 、 等常 用 试 剂 购 自 宝 生 物 工 程 （ 大 连 ） 有 限 公 司； Cellfectin 脂质体 购 自 Invitrogen Corporation ； 质 粒 提 取试剂盒（ E. Z. N. A. TM Plasmid Mini Kit I ） 及胶 回收试剂盒（ E. Z. N. A. TM Gel Extraction Kit ） 购 自 Omega Bio-Tek 公 司； HA 抗 体 购 自 Convance 公 司； ECL 显 色 试 剂 盒 购 自 Amersham Biosciences 公 司； goat-anti-mouse-HRP 第 二 抗 体 购 自 华 美 生 物 工 凝胶成像系 程公司 。 电泳 装 置 购 自 Bio-Rad 公 司， PCR 仪 购 自 MJ Research Inc. ， 统购自 Kodak 公 司， 倒置荧光显微镜购自 Nikon 公司 。 1. 1. 4 引物：本研究所用 PCR 引物是根据 AcMNPV 基 运 用 DNASTAR 软 件 设 计， 由 Invitrogen 因组 全 序 列， Corporation 合成。引物序列及酶切位点见表 1 。
研究报告
杆状病毒 AcMNPV p48 基因在昆虫细胞中的表达
* 袁美妗 ， 黄振球 ， 胡朝阳 ， 杨凯 ， 庞义
（ 中山大学有害生物控治与资源利用国家重点实验室，广州
510275 ）
p48 （ ac103 Fra Baidu bibliotek 基因在昆虫 杆 状 病 毒 中 高 度 保 守， 摘要： 【 目的 】 暗 示 其 具 有 重 要 的 生 物 学 功 能。为 了 研 究 该 基 — — 苜蓿银纹夜蛾核型多角 因的功能， 我们首先对该基因的表达特征进行描述。【方法 】 以杆状病毒代表种 — 体病毒（ Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus ，AcMNPV ） 的 p48 基 因 为 研 究 对 象， 利 用 Bac-toBac 杆状病毒表达载体系统分别构建了在 P48 蛋白 N-端和 C-端融合 HA-标签， 并且携带绿色荧光蛋白基因 和多角体蛋白基因的重组 Bacmid 。 将 重 组 Bacmid 转 染 Sf9 细 胞， 收 集 含 病 毒 的 上 清 去 感 染 Sf9 细 胞， 在感 染后不同时间点收集细胞进行 SDS-PAGE 电泳， 利用商业化的 HA 抗体进行 Western blot 分析以检测融合蛋 白在昆虫细胞中的表达情况。 【结 果 】 用 C-端 融 合 HA-标 签 的 重 组 病 毒 感 染 细 胞 后 12 h 即 可 检 测 到 一 条 43 kDa 左右 、 能与 HA 抗体发生特异性结合的蛋白条带， 该 特 异 性 蛋 白 的 表 达 一 直 持 续 到 病 毒 感 染 后 96 h 。 从感染后 48 h 起一直到 96 h ， 均能检测到另外一条约 26 kDa 的蛋白条带也能与 HA 抗体发生特异性结合 。 在 N-端融合 HA-标签的重组病毒感染的细胞中没有检测到与 HA 抗体特异结合的蛋白。【结论 】 结果表明， p48 基因是个晚期基因， 在病毒感染的晚期表达， 并且该蛋白在昆虫细胞中表达时 N-端可能被剪切 。 关键词 ： AcMNPV ； p48 基因；表达；剪切 中图分类号 ： Q786 文献标识码 ： A 6209 （ 2010 ） 04046507 文章编号 ：0001180 kb ， 可编码 90 － 180 个 基 因 。 从 1994 年 杆 状 病 — —苜 蓿 银 纹 夜 蛾 核 型 多 角 体 病 毒 毒 代 表 种— （ Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus ， AcMNPV ） 的全基 因 组 序 列 公 布［8 ］， 至 今 已 有 50 株 46 株 病 毒 杆状病毒的全基因组序列 被 测 定 。 其 中， 的宿主是鳞翅目昆虫， 膜翅目昆虫病毒 3 株， 双翅目 昆虫病毒 1 株
翅目和膜翅目昆虫杆状病毒基 因 组 中；17 个 基 因 存 在于所有 鳞 翅 目 昆 虫 杆 状 病 毒 基 因 组 中 期中 起 重 要 作 用
［ 12 ］ ［ 9］
。这种
高度保守性表明这些基因可能在杆状病毒的生活周 。 p48 （ AcMNPV ORF103 ， ac103 ） 基因在除了双翅目昆虫杆状病毒 Culex nigri -
［ 13 ］
（ enhanced green fluorescence protein gene ，egfp ， 在文 中简称为 gfp ） 双 标 记 的 质 粒 pFB1-PH-GFP 为 本 室 构建
［ 15 ］
；转移载体质粒 pFB1-P48-PH-GFP 、 缺失 p48
P48-KO 基因的重组病毒 vAc 以 及 带 polh 和 gfp 双 标 记 P48-KO-PH-GFP 由 Yuan 的 p48 基 因 缺 失 型 重 组 病 毒 vAc
PCR 扩增所用引物
PCR primers used for amplification
Restriction endonuclease Eco RI Sal I Sal I Xba I Eco RI Sal I Sal I
；此
现有 32 个基因在所有杆状病毒中均存在， 称为核心
［ 10 － 11 ］ ； 11 个 基 因 存 在 于 所 有 的 鳞 基因（ core gene ）
外， 杆状病毒作为基因转移载体可用于基因治疗， 是 。目前杆状 病毒的研究已经引起人们的高度重视 。 随着对杆状 病毒基因组的深入 研 究， 人们正在从分子水平上揭 示杆状病毒的作用机制 。 杆状病毒基因组为双链闭环 DNA ， 长度为 80 －
作者简介 ： 袁美妗（ 1974 － ） ， 女， 福建柘荣人， 博士， 讲师， 主要从事杆状病毒功能基因组学研究 。 E-mail ： lssymj@ mail. sysu. edu. cn 收稿日期 ：2009 -10 -14 ； 修回日期 ：2010 -01 -06
466
Meijin Yuan et al. / Acta Microbiologica Sinica （ 2010 ） 50 （ 4 ）
Research Paper
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 50 （ 4 ） ：465 － 471 ； 4 April 2010 ISSN 0001 － 6209 ； CN 11 － 1995 / Q http ： / / journals. im. ac. cn / actamicrocn
“ 973 项目 ” （ 2009CB118903 ） ； 国家自然科学基金项目（ 30900941 ） 基金项目：国家
*
20 84113009 ； Fax ： + 8620 84037472 ； E-mail ： yangkai@ mail. sysu. edu. cn 通信作者 。 Tel ： + 86-
。 由于缺乏 合 适 的 抗 体， 目前国内外尚未
［ 14 ］
完成对该基因 的 表 达 特 征 的 研 究 。 Li 等
曾经尝
试在 大 肠 杆 菌 中 表 达 枞 色 卷 蛾 核 型 多 角 体 病 毒 （ Choristoneura fumiferana MNPV ， CfMNPV ） 的 p48 蛋 白， 之后免疫新西兰大白兔制备抗体， 得到的抗体虽 但在 然能 与 原 核 表 达 的 融 合 蛋 白 特 异 性 结 合， CfMNPV 感染的细胞样品中 却 检 测 不 到 信 号 。 推 测 可能是 P48 蛋白根本不表达；或者表达量太低， 常规 的蛋白免疫印迹检测不到 。 本研究选择了只含 9 个氨基酸的红血球凝集素 HA 为标签， 分别构 建 了 在 P48 蛋 白 N-端 和 C-端 融 合 HA 的 重 组 病 毒， 并 利 用 HA-标 签 的 抗 体 成 功 分 析了 P48 蛋白在重组病毒感染昆虫细胞中的表达时 相 。 这也为进一步研究 P48 蛋白在病毒粒子结构中 以及 P48 蛋白 与 其 他 蛋 白 间 的 相 互 作 用 奠 的定位， 定了基础 。
1
1. 1
材料和方法
材料 质粒 、 病毒和菌 株：质 粒 载 体 pMD18-T 购 自
1. 1. 1
宝生物工程（ 大连） 有限公司；带 AcMNPV 多角体蛋 白基 因 （ polyhedrin ， polh ） 和 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因
表1
Table 1
Primer P48 CHAP1 P48 CHAP2 P48 CHAP3 P48 HAP4 P48 NHAP1 P48 NHAP2 P48 NHAP3 Position in AcMNPV genome 89580 – 89600 89808 – 89827 N /A N /A 89539 – 89556 89519 – 89538 88375 – 88396
杆状病毒是昆虫专一性的病原体， 是发现最早 、 研究得最多且最为深入的昆虫病毒
［ 1 － 2］
。 杆状病毒
在农业 、 基础分子生 物 学 以 及 医 学 领 域 都 具 有 重 要 杆状 病 毒 是 控 制 昆 虫 种 群 的 重 要 生 的价值 。 首先， 可开发 成 生 物 杀 虫 剂 加 以 利 用 物因子，
palpus NPV 外的所有 杆 状 病 毒 中 均 存 在， 意味着该 基因可能具备重要功能 。 目前， 关于 p48 基 因 的 研 究 报 道 很 少 。 我 们 之 前 通 过 ET 重 组 技 术 从 AcMNPV bacmid （ 简 称 AcBac ） 中敲除该基 因， 构 建 成 缺 失 p48 基 因 的 重 组 AcMNPV［13 ］。 通过 对 该 重 组 病 毒 的 研 究 发 现， p48 基因是病毒复制的 必 需 基 因：在 该 病 毒 转 染 的 细 胞 中不 能 产 生 子 代 病 毒， 包 括 芽 生 型 病 毒 （ budded virus ，BV ） 和 包 埋 型 病 毒 （ occlusion-derived virus ， ODV ）
［ 3 － 5］
； 其 次，
杆状病毒还可作为外源基因表达载体系统表达外源 基因， 在药物研发 、 疫 苗 生 产 等 方 面 有 广 泛 的 应 用， 现已成 为 基 因 工 程 四 大 表 达 载 体 系 统 之 一 一种很 有 应 用 前 景 的 基 因 转 移 载 体
［ 7］ ［ 6］
。 比较 这 些 病 毒 基 因 组 的 序 列， 发
等构 建 1. 1. 2
［ 13 ］
； 大 肠 杆 菌 （ Escherichia coli ） DH10B 购 自
Invitrogen Corporation ， TG1 为本室保存 。 昆 虫 细 胞 和 血 清、 培 养 基： 草 地 贪 夜 蛾 （ Spodoptera frugiperda ） 细胞 Sf9 引 自 英 国 自 然 环 境 研 究 委 员 会 病 毒 研 究 所 （ NERC / Institute of Virology ，Oxford ，UK ） ； Grace's 培 养 基 和 胎 牛 血 清 （ fetal bovine serum ） 购自 Invitrogen Corporation ， 使用 时在 Grace's 培 养 基 中 添 加 10% 胎 牛 血 清 、 终浓度 为 100 μ g / mL 的青 霉 素 和 30 μ g / mL 的 链 霉 素， 双 无 培 养 基 即 为 无 血 清 无 抗 生 素 的 Grace's 培 养 基； LB 培养基参照文献［ 16 ］ 。 1. 1. 3 T4 DNA 主 要 试 剂 和 仪 器： 限 制 性 内 切 酶 、 Premix Ex Taq Hot Start Version PCR 试剂盒 连接酶 、 等常 用 试 剂 购 自 宝 生 物 工 程 （ 大 连 ） 有 限 公 司； Cellfectin 脂质体 购 自 Invitrogen Corporation ； 质 粒 提 取试剂盒（ E. Z. N. A. TM Plasmid Mini Kit I ） 及胶 回收试剂盒（ E. Z. N. A. TM Gel Extraction Kit ） 购 自 Omega Bio-Tek 公 司； HA 抗 体 购 自 Convance 公 司； ECL 显 色 试 剂 盒 购 自 Amersham Biosciences 公 司； goat-anti-mouse-HRP 第 二 抗 体 购 自 华 美 生 物 工 凝胶成像系 程公司 。 电泳 装 置 购 自 Bio-Rad 公 司， PCR 仪 购 自 MJ Research Inc. ， 统购自 Kodak 公 司， 倒置荧光显微镜购自 Nikon 公司 。 1. 1. 4 引物：本研究所用 PCR 引物是根据 AcMNPV 基 运 用 DNASTAR 软 件 设 计， 由 Invitrogen 因组 全 序 列， Corporation 合成。引物序列及酶切位点见表 1 。
研究报告
杆状病毒 AcMNPV p48 基因在昆虫细胞中的表达
* 袁美妗 ， 黄振球 ， 胡朝阳 ， 杨凯 ， 庞义
（ 中山大学有害生物控治与资源利用国家重点实验室，广州
510275 ）
p48 （ ac103 Fra Baidu bibliotek 基因在昆虫 杆 状 病 毒 中 高 度 保 守， 摘要： 【 目的 】 暗 示 其 具 有 重 要 的 生 物 学 功 能。为 了 研 究 该 基 — — 苜蓿银纹夜蛾核型多角 因的功能， 我们首先对该基因的表达特征进行描述。【方法 】 以杆状病毒代表种 — 体病毒（ Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus ，AcMNPV ） 的 p48 基 因 为 研 究 对 象， 利 用 Bac-toBac 杆状病毒表达载体系统分别构建了在 P48 蛋白 N-端和 C-端融合 HA-标签， 并且携带绿色荧光蛋白基因 和多角体蛋白基因的重组 Bacmid 。 将 重 组 Bacmid 转 染 Sf9 细 胞， 收 集 含 病 毒 的 上 清 去 感 染 Sf9 细 胞， 在感 染后不同时间点收集细胞进行 SDS-PAGE 电泳， 利用商业化的 HA 抗体进行 Western blot 分析以检测融合蛋 白在昆虫细胞中的表达情况。 【结 果 】 用 C-端 融 合 HA-标 签 的 重 组 病 毒 感 染 细 胞 后 12 h 即 可 检 测 到 一 条 43 kDa 左右 、 能与 HA 抗体发生特异性结合的蛋白条带， 该 特 异 性 蛋 白 的 表 达 一 直 持 续 到 病 毒 感 染 后 96 h 。 从感染后 48 h 起一直到 96 h ， 均能检测到另外一条约 26 kDa 的蛋白条带也能与 HA 抗体发生特异性结合 。 在 N-端融合 HA-标签的重组病毒感染的细胞中没有检测到与 HA 抗体特异结合的蛋白。【结论 】 结果表明， p48 基因是个晚期基因， 在病毒感染的晚期表达， 并且该蛋白在昆虫细胞中表达时 N-端可能被剪切 。 关键词 ： AcMNPV ； p48 基因；表达；剪切 中图分类号 ： Q786 文献标识码 ： A 6209 （ 2010 ） 04046507 文章编号 ：0001180 kb ， 可编码 90 － 180 个 基 因 。 从 1994 年 杆 状 病 — —苜 蓿 银 纹 夜 蛾 核 型 多 角 体 病 毒 毒 代 表 种— （ Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus ， AcMNPV ） 的全基 因 组 序 列 公 布［8 ］， 至 今 已 有 50 株 46 株 病 毒 杆状病毒的全基因组序列 被 测 定 。 其 中， 的宿主是鳞翅目昆虫， 膜翅目昆虫病毒 3 株， 双翅目 昆虫病毒 1 株
翅目和膜翅目昆虫杆状病毒基 因 组 中；17 个 基 因 存 在于所有 鳞 翅 目 昆 虫 杆 状 病 毒 基 因 组 中 期中 起 重 要 作 用
［ 12 ］ ［ 9］
。这种
高度保守性表明这些基因可能在杆状病毒的生活周 。 p48 （ AcMNPV ORF103 ， ac103 ） 基因在除了双翅目昆虫杆状病毒 Culex nigri -
［ 13 ］
（ enhanced green fluorescence protein gene ，egfp ， 在文 中简称为 gfp ） 双 标 记 的 质 粒 pFB1-PH-GFP 为 本 室 构建
［ 15 ］
；转移载体质粒 pFB1-P48-PH-GFP 、 缺失 p48
P48-KO 基因的重组病毒 vAc 以 及 带 polh 和 gfp 双 标 记 P48-KO-PH-GFP 由 Yuan 的 p48 基 因 缺 失 型 重 组 病 毒 vAc
PCR 扩增所用引物
PCR primers used for amplification
Restriction endonuclease Eco RI Sal I Sal I Xba I Eco RI Sal I Sal I
；此
现有 32 个基因在所有杆状病毒中均存在， 称为核心
［ 10 － 11 ］ ； 11 个 基 因 存 在 于 所 有 的 鳞 基因（ core gene ）
外， 杆状病毒作为基因转移载体可用于基因治疗， 是 。目前杆状 病毒的研究已经引起人们的高度重视 。 随着对杆状 病毒基因组的深入 研 究， 人们正在从分子水平上揭 示杆状病毒的作用机制 。 杆状病毒基因组为双链闭环 DNA ， 长度为 80 －
作者简介 ： 袁美妗（ 1974 － ） ， 女， 福建柘荣人， 博士， 讲师， 主要从事杆状病毒功能基因组学研究 。 E-mail ： lssymj@ mail. sysu. edu. cn 收稿日期 ：2009 -10 -14 ； 修回日期 ：2010 -01 -06
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Meijin Yuan et al. / Acta Microbiologica Sinica （ 2010 ） 50 （ 4 ）
Research Paper
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 50 （ 4 ） ：465 － 471 ； 4 April 2010 ISSN 0001 － 6209 ； CN 11 － 1995 / Q http ： / / journals. im. ac. cn / actamicrocn
“ 973 项目 ” （ 2009CB118903 ） ； 国家自然科学基金项目（ 30900941 ） 基金项目：国家
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20 84113009 ； Fax ： + 8620 84037472 ； E-mail ： yangkai@ mail. sysu. edu. cn 通信作者 。 Tel ： + 86-
。 由于缺乏 合 适 的 抗 体， 目前国内外尚未
［ 14 ］
完成对该基因 的 表 达 特 征 的 研 究 。 Li 等
曾经尝
试在 大 肠 杆 菌 中 表 达 枞 色 卷 蛾 核 型 多 角 体 病 毒 （ Choristoneura fumiferana MNPV ， CfMNPV ） 的 p48 蛋 白， 之后免疫新西兰大白兔制备抗体， 得到的抗体虽 但在 然能 与 原 核 表 达 的 融 合 蛋 白 特 异 性 结 合， CfMNPV 感染的细胞样品中 却 检 测 不 到 信 号 。 推 测 可能是 P48 蛋白根本不表达；或者表达量太低， 常规 的蛋白免疫印迹检测不到 。 本研究选择了只含 9 个氨基酸的红血球凝集素 HA 为标签， 分别构 建 了 在 P48 蛋 白 N-端 和 C-端 融 合 HA 的 重 组 病 毒， 并 利 用 HA-标 签 的 抗 体 成 功 分 析了 P48 蛋白在重组病毒感染昆虫细胞中的表达时 相 。 这也为进一步研究 P48 蛋白在病毒粒子结构中 以及 P48 蛋白 与 其 他 蛋 白 间 的 相 互 作 用 奠 的定位， 定了基础 。
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材料和方法
材料 质粒 、 病毒和菌 株：质 粒 载 体 pMD18-T 购 自
1. 1. 1
宝生物工程（ 大连） 有限公司；带 AcMNPV 多角体蛋 白基 因 （ polyhedrin ， polh ） 和 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因
表1
Table 1
Primer P48 CHAP1 P48 CHAP2 P48 CHAP3 P48 HAP4 P48 NHAP1 P48 NHAP2 P48 NHAP3 Position in AcMNPV genome 89580 – 89600 89808 – 89827 N /A N /A 89539 – 89556 89519 – 89538 88375 – 88396