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DNA提取及常见问题分析解析
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。
第二部分：DNA提取方法简介
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
线粒体、叶绿体DNA的提取 ➢ 差速离心结合SDS裂解法
核酸分离、纯化
多糖的去除：
➢ 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
➢ 用多糖水解酶将多糖降解。
➢ 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。
➢ 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入 200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份
Tris-
HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）NaCl
CTAB
β-巯基乙 醇
终浓度
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/ V)
0.1% （V/V）使 用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
终浓 度
Tris-HCl EDTA NaC （pH8.0） （pH8.0）l
CTAB
100 mM
20 mM
1.4 M
3%(W/ V)
PVP40
β-巯基乙 醇
5%(W/ V)
2%（V/V） 使用前加 入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
2%
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、 冻融法
➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
基因组DNA的提取
➢ 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体 系
➢ 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方 法
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
➢ 酚/氯仿抽提 ➢ 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） ➢ 高盐洗涤 ➢ 蛋白酶处理
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
基因组DNA－其它方法
➢ 浓盐法：
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
➢ 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
第二三部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
➢ 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 ➢ 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） ➢ 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 ➢ 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
细胞裂解
基因组DNA的提取
➢ 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞Байду номын сангаас－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
➢ 高温温浴时，定时轻柔振荡
核酸分离、纯化
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-HCl EDTA （pH8.0） （pH 8.0 ）NaCl
SDS
终浓 度
10 mM
20 mM 0.4M
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。
第二部分：DNA提取方法简介
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
线粒体、叶绿体DNA的提取 ➢ 差速离心结合SDS裂解法
核酸分离、纯化
多糖的去除：
➢ 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
➢ 用多糖水解酶将多糖降解。
➢ 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。
➢ 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入 200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份
Tris-
HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）NaCl
CTAB
β-巯基乙 醇
终浓度
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/ V)
0.1% （V/V）使 用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
终浓 度
Tris-HCl EDTA NaC （pH8.0） （pH8.0）l
CTAB
100 mM
20 mM
1.4 M
3%(W/ V)
PVP40
β-巯基乙 醇
5%(W/ V)
2%（V/V） 使用前加 入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
2%
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、 冻融法
➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
基因组DNA的提取
➢ 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体 系
➢ 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方 法
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
➢ 酚/氯仿抽提 ➢ 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） ➢ 高盐洗涤 ➢ 蛋白酶处理
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
基因组DNA－其它方法
➢ 浓盐法：
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
➢ 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
第二三部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
➢ 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 ➢ 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） ➢ 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 ➢ 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
细胞裂解
基因组DNA的提取
➢ 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞Байду номын сангаас－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
➢ 高温温浴时，定时轻柔振荡
核酸分离、纯化
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-HCl EDTA （pH8.0） （pH 8.0 ）NaCl
SDS
终浓 度
10 mM
20 mM 0.4M
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；